[發(fā)明專利]一種用于檢測犬細小病毒的膠體金試紙條

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310705249.8
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103743901A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 王凈;史利軍;李剛;王鵬
• 申請（專利權）人: 河北北方學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體涉及一種用于檢測犬細小病毒的膠體金試紙條及其應用。

背景技術

膠體金免疫層析技術(Gold?Immunochromatographic?assay,GICA)是一種基于抗原和抗體特異性反應的標記診斷技術，1971年Faulk把膠體金引入免疫化學，從而誕生了免疫膠體金技術。20世紀80年代又興起了以NC膜為固相載體的免疫膠體金檢測技術，該技術是在McAb、ELISA等技術基礎上發(fā)展起來的一種快速而簡單的新型診斷技術。劉煜凱等1995年將免疫層析法作早孕快速診斷測定，隨后出現(xiàn)了人早孕試紙條的廣泛應用。郝桂蘭等利用免疫膠體金試驗，采取病死鴿棉拭子樣品30min內(nèi)即完成對一發(fā)病鴿群的快速鑒別診斷。王長美等用免疫膠體金試驗診斷出患禽Ⅰ型副黏病毒病的鵝群。徐葛林等制備了適于野外對動物腦或唾液中的狂犬病病毒抗原檢測的診斷試紙條。鄭鳴等運用雙抗原夾心法于國內(nèi)首先建立了豬瘟病毒抗體檢測免疫層析試紙條。劉春龍等建立了檢測牛初乳中免疫球蛋白(IgG)含量的免疫膠體金法。李恪梅等用布魯菌純蛋白衍化物作為該檢測板的包被抗原，建立了用間接法檢測人和不同動物血液樣品中的抗布魯菌抗體的新方法。

膠體金（Colloidal?gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在堿性條件下帶負電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團借靜電吸引而形成牢固結(jié)合。

GICA的原理是以膠體金作為示蹤標記物，以微孔膜為固相載體，包被已知抗原或抗體，加入待測樣后，經(jīng)微孔膜的滲濾作用或毛細管虹吸作用使樣本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標記物與之反應形成紅色的可見結(jié)果。最常用的是雙抗夾心法檢測抗原。

測定時將試紙條下端浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的膠體金復合物復溶，并帶動其向膜條滲移。標本中待測特異抗原，可與膠體金復合物中的抗體結(jié)合，此抗原抗體復合物流至測試區(qū)即被固相抗體捕獲，在膜上顯出紅色反應線條（T）。過剩的膠體金復合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相抗小鼠IgG結(jié)合（膠體金復合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而顯出紅色質(zhì)控線條（R）。陰性標本則無反應線條，而僅顯示質(zhì)控線條

目前，最常應用的檢測犬細小病毒（CPV）的方法是血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)及ELISA方法。其中HA試驗最為經(jīng)濟，但是也存在缺點，一方面獲取造價昂貴新鮮的紅細胞比較困難，另一方面，該方法只適用于CPV感染后期樣本檢測，不適應近年來早期、快速檢測的要求。ELISA方法則應用較多，但操作要求較高，并且還需要酶標儀判定結(jié)果，因此不適于基層使用。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于CPV感染早期的檢測試劑條，利用該試劑條檢測犬細小病毒，方法簡單、檢測時間短、成本低。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測犬細小病毒的膠體金試紙條，所述膠體金試劑條包含：

1）包被犬細小病毒抗原的多克隆抗體和二抗IgG兩個條帶的硝酸纖維膜；

2）含有膠體金標記犬細小病毒抗原的單克隆抗體的玻璃纖維膜。

其中，所述的二抗IgG為羊抗鼠IgG抗體。

進一步地，所述硝酸纖維膜中犬細小病毒抗原的多克隆抗體的濃度為1mg/mL，所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為1mg/mL。

作為優(yōu)選，所述玻璃纖維膜中膠體金標記的犬細小病毒抗原的單克隆抗體的標記pH值為8.5，單克隆抗體與膠體金結(jié)合濃度為40μg/mL。

作為優(yōu)選，所述膠體金顆粒平均直徑為25nm。

進一步地，所述膠體金試紙條能檢出犬細小病毒最低HA效價為1:80。

前述膠體金試紙條，還包括底板、樣品墊和吸水紙，所述底板上黏貼硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上方粘貼吸水紙，硝酸纖維膜下方依次相互搭接粘貼玻璃纖維膜和樣品墊。

本發(fā)明還提供了一種制備前述膠體金試紙條的方法，包括如下步驟：

1）制備犬細小病毒抗原的多克隆抗體；

2）硝酸纖維膜的制備：將犬細小病毒抗原的多克隆抗體稀釋成1mg/mL，將羊抗鼠IgG抗體稀釋成1mg/mL；將硝酸纖維膜貼于底板后，用三維劃膜儀在硝酸纖維膜上劃上上述犬細小病毒抗原的多克隆抗體與羊抗鼠IgG抗體，分別形成檢測線和質(zhì)控線，室溫包被過夜，備用；