[發(fā)明專利]一種大黃魚肝臟細胞系及其建立方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310703543.5
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103992981A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王藝磊;莊道華;張子平;李敏
• 申請（專利權(quán)）人: 集美大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 李雁翔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大黃魚肝臟細胞系及其建立方法。?

背景技術(shù)

大黃魚（Larimichthys?crocea），硬骨魚綱，鱸形目，石首魚科，黃魚屬。肉質(zhì)鮮嫩，經(jīng)濟價值較高，市場需求量較大。上世紀70年代以前野生大黃魚資源較充沛，年平均捕撈量一度達到12萬噸的水平。70年代初由于對野生大黃魚尤其是對其越冬群體的濫捕亂撈，致使野生大黃魚產(chǎn)量迅速枯竭。80年代以后，隨著近海經(jīng)濟開發(fā)、環(huán)境污染等原因，導(dǎo)致近海的原各大產(chǎn)卵場不再適宜大黃魚產(chǎn)卵，現(xiàn)野生大黃魚捕獲量極低。1986年大黃魚人工育苗得以突破，隨后得到重視迅猛發(fā)展，現(xiàn)階段市場大黃魚都是由海水養(yǎng)殖大黃魚來提供^[84]。然而，現(xiàn)階段伴隨工業(yè)化發(fā)展，近海養(yǎng)殖環(huán)境進一步惡化；大黃魚病害頻發(fā)；大黃魚親魚資源枯竭，種質(zhì)退化等因素極大的限制了大黃魚養(yǎng)殖的進一步發(fā)展，現(xiàn)階段大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)量約8.6萬噸，不及70年代以前的捕撈量。因此對大黃魚病害防治、良種選育、遺傳背景的研究極為迫切。?

建立魚類細胞系能為魚類病毒分離、抗病毒機制、疫苗研發(fā)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、嵌合體組織工程等研究提供極大的便捷，且設(shè)施人力等資源要求相對活體實驗低，重復(fù)性好，研究周期短。目前關(guān)于大黃魚細胞系的建立僅有孫愛在2010年報道建立了大黃魚成魚的魚鰭、吻端、脾臟三種細胞系，而未見其他組織細胞系的報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種大黃魚肝臟細胞系。?

本發(fā)明的另一目的在于提供上述大黃魚肝臟細胞系的建立方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：?

一種大黃魚肝臟細胞系（即生物材料樣品保藏證明中的大黃魚肝細胞系LYCL），該細胞系于2013年10月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國.武漢.武漢大學），保藏登記入冊編號為CCTCC?NO:C2013157。?

本發(fā)明的另一技術(shù)方案如下：?

一種上述大黃魚肝臟細胞系的建立方法，包括如下步驟：?

（1）大黃魚肝臟組織的獲取：將7個月大，長9-11cm的大黃魚魚苗在含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌海水（青霉素及鏈霉素雙抗購自康寧公司，該雙抗的100X濃縮液含10000U/mL青霉素以及10000μg/mL鏈霉素，配制海水時每100mL海水加入1mL青霉素及鏈霉素雙抗的100X濃縮液）中暫養(yǎng)1-1.5h，然后滴入占滅菌海水體積0.005-0.015%的丁香酚，直至魚體翻轉(zhuǎn)，腹部朝上，對刺激物應(yīng)激行為為止；以滅菌紗布塊擦除魚體表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭魚體表面后，取出大黃魚肝臟組織并置于含青霉素及鏈霉素雙抗的D-hanks液（100mL?D-hanks液加入1mL青霉素及鏈霉素雙抗的100X濃縮液）中；?

（2）原代培養(yǎng)：將上述大黃魚肝臟組織切碎至0.7-2.0mm³的小組織塊，以D-hanks液漂洗，最后以完全培養(yǎng)液漂洗；漂洗后將上述小組織塊接種于細胞培養(yǎng)瓶中，吸除多余培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)瓶身27℃恒溫干貼24h，再加入完全培養(yǎng)液，翻正瓶身以使小組織塊浸入培養(yǎng)液中，于27℃恒溫培養(yǎng)啟動原代培養(yǎng)，每周更換完全培養(yǎng)液一次；?

（3）傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)至貼壁細胞增殖至至少50-60%覆蓋率時，移除舊培養(yǎng)液,并清洗去除殘留的血清和二價金屬離子；然后以0.25%胰酶消化法傳代懸起細胞，以1:2-10進行傳代；以后每隔2-8天傳代一次，所述大黃魚肝臟細胞系建立成功。?

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述完全培養(yǎng)液中包括：DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清FBS、β-巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及鏈霉素。?

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述完全培養(yǎng)液為：以DMEM/F12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，包括終濃度分別為16.7%胎牛血清FBS、0.5‰β-巰基乙醇、50μg/mL?N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纖維素鈉、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、1μg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100μg/mL鏈霉素。?

本發(fā)明的有益效果是：?

1、本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系可連續(xù)傳代，迄今已傳代40代，能夠提供大量的大黃魚肝臟細胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育種研究等。?

2、本發(fā)明的大黃魚肝臟細胞系的構(gòu)建方法重復(fù)性強、構(gòu)建的細胞系穩(wěn)定性好；?