[發明專利]一種大黃魚腦細胞系及其建立方法

在審

• 申請號: 201310703461.0
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN104004706A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 王藝磊;莊道華;張子平;李敏
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 李雁翔

1.一種大黃魚腦細胞系，其特征在于：該細胞系于2013年10月31日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏登記入冊編號為：CCTCC?NO:C2013156。?

2.一種權利要求1所述的大黃魚腦細胞系的建立方法，其特征在于：包括如下步驟：?

（1）大黃魚腦組織的獲取：將7個月大，長9-11cm的大黃魚魚苗在含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌海水中暫養1-1.5小時，然后滴入占滅菌海水體積0.005-0.015%的丁香酚，直至魚體翻轉，腹部朝上，對刺激物應激行為為止；以滅菌紗布塊擦除魚體表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭魚體表面后，取出大黃魚腦組織并置于含青霉素及鏈霉素雙抗的D-hanks液中；?

（2）原代培養：將上述大黃魚腦組織切碎至0.7-2.0mm³的小組織塊，以D-hanks液漂洗，最后以完全培養液洗；漂洗后將上述小組織塊接種于細胞培養瓶中，吸除多余培養液，翻轉瓶身27℃恒溫干貼24小時，再加入完全培養液翻正瓶身以使小組織塊浸入培養液中，于27℃恒溫培養啟動原代培養，每周更換完全培養液一次；?

（3）傳代培養：原代培養至貼壁細胞增殖至至少50-60%覆蓋率時，移除舊培養液,并清洗去除殘留的血清和二價金屬離子；然后以0.25%胰酶消化法傳代懸起細胞，以1:2-10進行傳代；以后每隔2-8天傳代一次，所述大黃魚腦細胞系建立成功。?

3.如權利要求2所述的一種大黃魚腦細胞系的建立方法，其特征在于：所述完全培養液中包括：DMEM/F12培養液、胎牛血清FBS、β-巰基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纖維素鈉、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及鏈霉素。?

4.如權利要求3所述的一種大黃魚腦細胞系的建立方法，其特征在于：所述完全培養液為：以DMEM/F12培養液為基礎，包括終濃度分別為16.7%胎牛血清FBS、0.5‰β-巰基乙醇、50μg/mL?N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纖維素鈉、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、1μg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100μg/mL鏈霉素。?