[發(fā)明專利]六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310703366.0
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103937874A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 盧潔;溫志杰;施向東;莫祺紅;李小娟;吳志勇;吳平;何志強;白先放;何勇強
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

1.一種六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于：直接從加工過程中的六堡茶中提取真菌總DNA，然后采用PCR-DGGE技術檢測其中的真菌菌群組成。

2.根據(jù)權利要求1所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

<1>取不同發(fā)酵過程中的六堡茶樣品

<2>收集茶樣品的微生物菌體

<3>提取真菌總DNA

<4>真菌18S?rRNA的PCR擴增

以待測樣品的真菌總DNA為模板，使用帶GC夾子的通用引物進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收及純化；

<5>DGGE電泳分析

純化的PCR產(chǎn)物通過DGGE進行分離，染色后得到DGGE指紋圖譜，通過指紋圖譜分析真菌菌群構(gòu)成及菌群相對數(shù)量；

<6>DGGE條帶回收及序列分析

從凝膠中回收條帶，并以此為模板，使用不帶GC夾子的同一通用引物進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，對目的片段進行回收、純化及測序；測序結(jié)果和NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，確定六堡茶的真菌菌群結(jié)構(gòu)。

3.根據(jù)權利要求2所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<1>按以下操作進行：抽取大生產(chǎn)的茶堆的上層、中層和下層的茶葉，然后于無菌室內(nèi)將其混勻，制成包含上、中、下層茶葉的混樣。

4.根據(jù)權利要求3所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<2>按以下操作進行：采用玻璃珠震蕩法，先稱量50g混勻的茶葉于500mL的錐形瓶里面，加少量滅菌過的玻璃珠，再添加0.85％磷酸鹽緩沖液450mL，200rpm震蕩15min，然后用雙層紗布過濾掉茶葉，濾液使用500mL的離心瓶收集，10000rpm離心10min，收集沉淀。

5.根據(jù)權利要求4所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<3>按以下操作進行：采用液氮研磨裂解菌體，將沉淀從離心瓶轉(zhuǎn)移至滅菌的研缽，倒進適量的液氮，用力研磨，反復直至粉末狀，轉(zhuǎn)移粉末至50mL離心管，加入15mL的總DNA提取液，同時加入7.5mL的氯仿、7.5mL的Tris-平衡酚，輕輕上下顛倒混勻，10000rpm離心10min；取上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等量的氯仿，上下顛倒混勻后，10000rpm離心10min；取上清，加入等量的異丙醇沉淀，13000rpm，離心15min；收集的DNA用75％酒精洗滌2遍，加入約0.3mL的ddH₂O溶解，置-20℃保存。

6.根據(jù)權利要求2所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<4>按以下操作進行：

所述引物為對大多數(shù)真菌18S?rRNA基因5′末端具有特異性的帶GC發(fā)夾的通用引物，引物序列NL1（F）為5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列NL1（F）-GC為5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物序列LS2（R）為5’-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3’；

所述PCR擴增程序為95℃預變性5min，94℃?50sec，58.4℃?30sec，72℃?1min，循環(huán)36次，72℃延伸10min；

所述PCR擴增體系為Green?Master?Mix?25μL，引物NL1（F）-GC?1μL、濃度10μM/L，引物LS2（R）1μL、濃度10μM/L，樣品DNA模板1μL，ddH2O補足至50μL。

7.根據(jù)權利要求2所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<5>中DGGE電泳按以下操作進行：PCR產(chǎn)物通過DGGE進行分離，使用40%丙烯酰胺/甲叉基雙丙烯酰胺溶液（37.5/1）制備聚丙烯酰胺變性梯度凝膠，變性梯度范圍為30％～70％，使用的電泳緩沖液為1xTAE，電壓180V，60℃電泳6h；聚丙烯酰胺凝膠用Gel?Red染料染色，得DGGE圖譜。

8.根據(jù)權利要求7所述的六堡茶加工過程中真菌菌群的檢測方法，其特征在于步驟<6>按以下操作進行：電泳完后用于回收條帶的聚丙烯酰胺凝膠用Gel?Red染料染色約30min，去離子水漂洗10s，在紫外燈下用無菌手術刀片切下含有目的片段的膠塊，裝入一干凈滅菌的1.5mL?EP管中；用滅菌槍頭將凝膠搗碎，加20μL滅菌雙蒸水，放置4℃冰箱過夜；12000rpm離心10min，取1μL上清為模板，用不帶GC夾子的同一通用引物進行PCR擴增，PCR擴增程序為95℃預變性5min，94℃50sec，52℃30sec，72℃1min，循環(huán)36次，72℃延伸10min；擴增的目的DNA片段送測序；測序后，在RDP數(shù)據(jù)庫中用Classifier軟件包對序列進行歸類，并在GeneBank進行序列同源性比較；序列和所比對的同源性高的序列一起，用MEGA5.0軟件按距離矩陣法中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，通過自展方法重復抽樣1000次進行可靠性測試。