[發明專利]固定化的全人源ECM包被基質的制備方法

在審

• 申請號: 201310703338.9
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN104726398A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 陳慧敏;朱海林
• 申請（專利權）人: 江陰司特易生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及一種固定化的人臍帶來源的細胞外基質(extracelluar?matrix，ECM)的制備方法。

背景技術

人胚胎干細胞(human?embryonic?stem?cell，hESC)是具有自我更新能力的多能干細胞，它們從囊胚期的內細胞團分離得到，有分化為三胚層的能力，因此用于組織修復和藥物篩選的前景廣闊。適合hESC臨床應用的培養體系必須具有無動物源性，成分確定，適合大規模生產等優點。而hESCs對生長條件苛刻。只有合適的培養基質與培養基相互配合，才能長期維持其未分化狀態。在傳統的培養體系中，人胚胎干細胞通常分為有飼養層和無飼養層培養。在有飼養層培養體系中，hESC通常是在CF-1小鼠飼養層上進行培養。為了降低培養體系中的動物成分，制備適合hESC臨床應用的培養基質，一些人源細胞取代了小鼠的飼養層。盡管已經證實新生兒包皮成纖維細胞，成人皮膚成纖維細胞，人輸卵管上皮細胞，人臍帶來源細胞等可以支持hESC的生長，但是這種共培養體系的操作步驟繁瑣。首先需要將飼養層細胞用絲裂霉素C或伽馬射線處理，使其失去增殖能力。其次在hESCs每次傳代前都需要預鋪飼養層細胞，它們的狀態和密度都直接影響著hESCs的生長。為了簡化培養體系，很多人嘗試用各種細胞外基質(ECM)代替飼養層細胞。目前基質膠(Matrigel)是無飼養層培養體系中最常用的包被材料，它是從小鼠EHS肉瘤提取的，含有層黏連蛋白，膠原IV，硫酸乙酰肝素，巢蛋白等多種成分。但是Matrigel來源于小鼠EHS肉瘤，含有鼠源成分，所以不適合hESCs的臨床應用。為了減少培養體系中動物成分，使人胚胎干細胞更好地應用于臨床，一些無異源成分的ECM包被基質被應用于人胚胎干細胞的培養，如玻連蛋白，多肽，人胎盤提取的ECM等。但是它們的生產工藝復雜，不適合大規模生產，且效果不及飼養層細胞和Matrigel。本發明涉及的無異源成分的培養基質來源于人臍帶間充質細胞，制備方法簡單，是一種全人源的，可以長期保存的，適合人胚胎干細胞長期培養生長的固定化細胞外基質。

發明內容

本發明的目的在于提供一種固定化的全人源細胞外基質(extracelluar?matrix，ECM)包被基質及其制備方法，以降低人胚胎干細胞培養體系中的異源成分，為最終臨床級人胚胎干細胞的體外擴增探索出一個新的途徑。

固定化的人源ECM包被基質的制備步驟是：1)從人臍帶獲得臍帶間充質細胞；2)甲醇固定化人源ECM包被培養板的制備。

其中，從人臍帶獲得臍帶間充質細胞的方法為：

1)將從人足月胎兒得到的新鮮人臍帶用PBS沖洗三次；

2)把臍帶剪成小段，剝離兩動脈和一靜脈；

3)血管去除后，分離華通氏膠；

4)將分離出的華通氏膠剪成小塊，加入適量培養基，放入37℃的CO₂培養箱中培養；

5)培養三天后隔4-5天換液一次，2-3周后可見組織塊周圍有細胞爬出；

6)當細胞80％匯合后，進行傳代培養；

7)人臍帶間充質細胞P1代后每2-3天傳代一次。

其中，甲醇固定化人源ECM包被培養板的制備方法為：

1)將P5-P15代的人臍帶間充質細胞按正常傳代密度傳到培養板上；

2)待其生長4-5天達到100％匯合，以便積累足夠的ECM；

3)開始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室溫放置5-10分鐘；

5)裂解結束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗滌結束后，加入60％～100％甲醇室溫固定；

7)培養板真空干燥，4℃保存；

其中，上述甲醇固定化人源ECM包被培養板的制備方法中，所用試劑的配方為：

1)洗液1：10mM?Tris-HCl+10mM?EDTA，pH＝8.0，高壓滅菌后室溫保存；

2)裂解液：0.3％脫氧膽酸鈉+10mM?Tris-HCl+10mM?EDTA，pH=8.0，0.22μm濾膜過濾，室溫保存；

3)洗液2：1mM?EDTA，pH=8.0，高壓滅菌后室溫保存。

優選地，步驟6)中加入80％～90％甲醇室溫固定，固定時間5-10min。

本發明披露的固定化的全人源ECM包被基質及其制備方法主要有以下有益效果：

1)解決了hESCs培養中操作繁瑣的問題，制備了一種即用型的hESCs培養基質；