[發明專利]一種聚合血紅蛋白的超濾方法

在審

• 申請號: 201310703254.5
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103694344A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 李鳳娟;李燊;馮杰
• 申請（專利權）人: 天津工業大學
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域：

本發明涉及生物醫藥領域，特別是一種聚合血紅蛋白超濾方法。

(二)背景技術：

以輸入全血為主要手段的傳統輸血方式在醫療救護方面發揮了極為重要的作用，但同時其自身也存在難以克服的各種缺點，主要表現在：輸入前需進行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設施。為了解決上述矛盾，人們早在19世紀末就開始了有關紅細胞代用品的研究。紅細胞代用品是指具有擴充血容積、維持血管內外滲透壓平衡并且有載氧功能，用以代替人紅細胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研制經歷了從最初無載氧功能的血管擴容劑，如：高滲鹽溶液、羥乙基淀粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研制的以血紅蛋白為基礎各類產品與全血比較具有諸多優點，如：來源廣泛、安全潔凈、可長期保存、輸入人體前無需進行交叉配型，特別適用于戰爭、自然災害、以及其他突發事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內的物質，它的溶液作為紅細胞代用品比化學合成物質更具優越性。

目前已有5家以血紅蛋白為基礎的產品完成或接近完成了III期臨床研究，取得了明顯的進展。然而，這些產品應用于臨床時都程度不同地出現了諸如血管收縮、血壓升高，心臟、腎臟、肝臟等器官受損等毒副作用。雖然引起這類毒副作用的主要原因還需要進一步研究，但現在可以確定的是：一方面這些以血紅蛋白為基礎的血液代用品(HBOCs)以小分子的形式進入血管壁內皮細胞能結合細胞內的舒張因子一氧化氮，從而誘導系統血管收縮進而造成血壓升高；另一方面，由于小分子的粒徑小于腎小球的濾過作用的閾值，經腎臟排出體外，引起血紅蛋白尿，嚴重的還會造成腎功能損傷或衰竭。因此，對這些HBOCs中小分子要盡量的去除，目前降低HBOCs中小分子含量的技術主要是柱層析和超濾，但前者主要存在的問題是操作周期長、成本高、產品得率低、難以適應規模化生產需要，后者則不僅操作周期短、操作簡單且在操作的過程中不會對血紅蛋白的生物活性、二級結構等造成損傷。

目前已有比較多的超濾技術應用于蛋白質分子量分級分離的研究報道，如平板式膜應用于分離免疫球蛋白，在細胞色素丙的純化過程中使用超濾技術，應用萃取-超濾兩步法從過期人血中提純人血白蛋白，以及應用超濾技術分離血漿蛋白等。但超濾法用于HBOCs制品分子量的分級鮮見系統報道。超濾的原理是通過篩孔分離，主要利用壓力差為推動力使溶液中的大分子截留，溶液中溶劑和小分子從高壓側透過到低壓側的分離過程。溶質或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質和溶劑一起透過膜，而較大的物質則被截留。以戊二醛為交聯劑的PolyPHb是一種分子量連續分布且分布較寬的物質，采用本專利工藝使得制品分子量的分布較窄，且達到去除小分子的效果。

(三)發明內容：

本發明的目的在于提供一種聚合血紅蛋白超濾方法，它針對上述情況，發明一種操作簡便、成本低廉、高效的超濾工藝。

本發明的技術方案：一種聚合血紅蛋白超濾方法，其特征在于它包括以下步驟：(1)在超濾試驗裝置中，使溶液在泵送條件下正壓循環，調節蠕動泵的速度與調節閥來控制進口壓力為0.1MPa，回流壓力0.02MP，料液pH7.0～8.0，溫度4℃(由于PolyPHb溫度高會造成高鐵血紅蛋白產生及變性)，并在儲液罐里不斷補充磷酸鹽緩沖液，從而達到分離去掉溶液中小分子的目的。

上述步驟(1)中制備所用的原料天然紅細胞來源為人胎盤血或過期的庫存人血。

上述步驟(1)中先對純化血紅蛋白進行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。

上述步驟(1)中對聚合后血紅蛋白進行超濾，所用超濾膜堆規格為為100kD截留分子量。

上述步驟(1)中超濾聚合血紅蛋白濃度為0.5％。

上述步驟(1)中超濾緩沖液倍數是原始體積的8～10倍

本發明的工作原理為：篩孔分離，主要利用壓力差為推動力使溶液中的大分子截留，溶液中溶劑和小分子從高壓側透過到低壓側的分離過程。溶質或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質和溶劑一起透過膜，而較大的物質則被截留。以戊二醛為交聯劑的PolyPHb是一種分子量連續分布且分布較寬的物質，采用本專利工藝使得制品分子量的分布較窄，且達到去除小分子的效果。

本發明的技術效果在于：在優選合適超工藝上做了大量研究，結果表明，以結構、理化性質穩定、截留分子量合適、超濾效果最好為原則，確定超濾膜的規格為100kD截留分子量膜堆、PolyPHb濃度為0.5％、超濾倍數8～10倍為最適組和。

(四)具體實施方式：