[發明專利]一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法及試劑盒

無效

• 申請號: 201310703042.7
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103642834A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 周彥;周常勇;李中安
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭云

1.一種柑桔衰退病毒的表達載體構建方法，包括以下步驟：?

1）提取病株中柑桔衰退病毒的總RNA；?

2）以上述總RNA為模板，用引物ZYC357/ZYC358擴增啟動子，用引物ZYC412/ZYC415和ZYC479/ZYC480分別擴增柑桔衰退病毒基因組的片段1和片段2，所述的引物核苷酸序列分別為：?

ZYC357：5’-TACGCGATTTGGGTAAGTACCTATAGCAATTACAGATGGCTAGCA?AAGGAGAAGAACT-3’?

ZYC358：5’-ACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATGGACGACGAA?ACAAAGAAATTGAAG?A-3’?

ZYC412：5’-GCCTCTTAGCACTAGTATTTAAATTGGACCTATGTTGGCCCCCCAGTG-3’?

ZYC415：5’-CGAGAAGTCCTACCACTTTATAGTTGGCCTTTA-3’?

ZYC479：5’-CAAAC?CATGCGAGCTTACTTTAGTATG-3’?

ZYC480：5’-ATTCCCGGGGGTGATTTTGGGTTTAGAC-3’?

3）用含有綠色熒光蛋白的質粒和特異引物ZYC349/ZYC350擴增綠色熒光蛋白基因，引物ZYC349/ZYC350序列為：?

ZYC349：5’-AGTTCTTCTCCTTTGCTAGCCATCTGTAATTGCTATAGGTACTTACCCAAATCGCGTA-3’?

ZYC350：5’-AGAGCTAATGTGGGTAGTTGAGTCAGGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’?

4）將步驟2、3中獲得的啟動子、片段1、片段2和綠色熒光蛋白基因的擴?增產物經切膠純化后，分別與載體進行鏈接、轉化，并對獲得的菌液進行質粒純化；?

5）取步驟4中的純化后分別含啟動子和片段2的質粒混合，通過overloop?PCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC358，從而得到35S-127，并進行濃縮；將純化后分別含片段1和綠色熒光蛋白基因的質粒進行混合，通過overloop?PCR進行連接，正反向引物為ZYC349/415，從而得到35S-126；將濃縮后的35S-126和35S-127混合，再次通過overloop?PCR進行連接，正反向引物為ZYC479/ZYC415，從而得到35S-128，并進行濃縮；?

6）取步驟5中所述濃縮后的35S-128與柑桔衰退病毒全長侵染性克隆35S-148分別進行StuI/PacI雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，進行切膠回收，純化后的酶切產物混合并進行鏈接，鏈接產物經轉化、質粒純化后從而得到柑桔衰退病毒的表達載體35S-149。?