[發明專利]一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 201310701767.2
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103725622A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 范代娣;馬曉軒;李林波;張鳳龍;王俊
• 申請（專利權）人: 西安巨子生物基因技術股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/12;C12N15/81;C07K14/78;C12R1/84
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 李罡

技術領域

????本發明涉及一種基因工程菌，具體涉及一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

膠原是哺乳動物體內含量最高（約占體內總蛋白含量的25%）、作用最為廣泛的一類大分子蛋白，膠原作為細胞外基質的主要成分在細胞分化、遷移等生理行為中起重要作用。隨著組織工程科學的不斷發展，以及再生醫學研究的不斷進步，膠原的應用愈加廣泛。重組膠原蛋白由于其產品質量均一、無病毒性隱患和過敏性反應，且易于規模化生產等特點，將逐漸替代天然膠原成為組織工程研究的重要材料。

目前，國外已經實現三螺旋膠原蛋白的表達，其表達系統有動物表達系統，植物表達系統和微生物表達系統。微生物系統對于生產重組膠原蛋白和重組明膠來說，有著低成本、產品質量均一、高效可放大的優勢。目前用于重組表達人膠原蛋白或明膠的宿主菌有畢赤酵母、釀酒酵母、漢遜酵母、大腸桿菌與短桿菌。但對于膠原和明膠，畢赤酵母是最優的生產系統。畢赤酵母的重組菌可以在胞內產生羥基化的三螺旋重組人膠原可達到1.5g/L。與重組膠原共表達脯氨酸羥化酶可以合成與天然膠原相似的熱穩定性的羥基化膠原。純化得到的羥基化重組膠原纖維在結構上與天然膠原相同。這些質量可以使重組膠原的醫學用途更加有吸引力。國外研究結果表明，畢赤酵母分泌重組膠原或明膠產量達到3-14g/L。早在20世紀90年代，芬蘭大學在酵母中多基因共表達前膠原與脯氨酸羥化酶，獲得了重組三螺旋膠原。美國Fibrogen公司也實現了膠原的三螺旋結構表達并申請了專利，他們通過共表達羥基化酶對膠原肽鏈Pro進行修飾，細胞破碎提取并純化膠原單鏈，在體外創造自組裝環境，進而形成三螺旋膠原。

天然膠原得重組表達在國內至今沒有相關的研究，但都集中在表達類人膠原和明膠片段的研究上。西北大學范代娣用大腸桿菌表達自行設計的類人膠原，產量穩定且高達20g/L；華澳利康采用畢赤酵母表達膠原蛋白融合肽也取得一定的進展，南京理工大學也在進行相關方面的研究等。

由于天然三螺旋膠原的重組表達，工藝極其復雜，并且很難實現其規模化生產，因此重組表達天然膠原單鏈和明膠片段不失為理想的選擇。分泌全長膠原單鏈雖然有相關方面的研究，但都不能有效克服其易降解的缺點，且實驗室研究較多，未規模化生產。

為了充分發揮人I型膠原蛋白在生物醫用材料中的作用，實現該蛋白的大規模產業化應用，首先要實現該蛋白的大量、穩定的表達，并可以分泌到胞外。由于市場上存在的膠原產品，多是從動物中提取的膠原，從而存在病毒性隱患以及產品質量不均一等問題，限制了其在生物醫用材料中的廣泛應用。

發明內容

本發明的目的是提供一種轉基因畢赤酵母基因工程菌及其構建方法與應用，能高效、安全地進行I型膠原α1鏈蛋白的胞外分泌表達。

本發明所采用的技術方案是：

一種轉基因畢赤酵母基因工程菌，其特征在于：

所述的基因工程菌于2013年8月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7981。

所述的基因工程菌是對從人胎盤組織中克隆出的人I型膠原α1鏈基因Col1a1進行改造后，與表達載體pPIC9K載體連接，導入畢赤酵母菌SMD1168中構建而成的基因工程菌。

一種轉基因畢赤酵母基因工程菌的構建方法，其特征在于：

由以下步驟實現：

步驟一：從人胎盤組織中克隆出I型膠原α1鏈基因Col1a1；

步驟二：對I型膠原α1鏈基因Col1a1涉及XhoI酶切位點的堿基進行突變改造；

步驟三：將改造后的I型膠原α1鏈基因Col1a1與表達載體pPIC9K載體連接，構建出表達質粒pPIC9K-Col1a1；

步驟四：將構建的表達質粒pPIC9K-Col1a1酶切線性化后，導入畢赤酵母菌SMD1168中；

步驟五：測定I型膠原α1鏈基因Col1a1轉化進入了畢赤酵母菌SMD1168中，從而得到轉基因畢赤酵母工程菌。

步驟二得到的改造后的Col1a1基因序列為SEQ?ID?No.1。

所述的一種轉基因畢赤酵母基因工程菌在I型膠原α1鏈蛋白高效表達中的應用。

所表達的I型膠原α1鏈蛋白Col1a1，其氨基酸序列為SEQ?ID?No.2。

本發明具有以下優點：