[發明專利]一株產角蛋白酶的金色鏈霉菌及其應用方法

有效

• 申請號: 201310701537.6
• 申請日: 2013-12-19
• 公開（公告）號: CN103642739A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 張旦旦;王月;史勁松;許正宏;張曉梅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/52;C12R1/49
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株產角蛋白酶的金色鏈霉菌及其粗酶性質。

背景技術

我國每年產生大量的家禽羽毛和廢次羊毛，其主要成分是角蛋白。由于角蛋白存在大量的二硫鍵、氫鍵和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成環境污染。角蛋白酶可將家禽羽毛、廢次羊毛降解轉變為可溶蛋白質、多肽或者氨基酸，用作醫藥原料、動物飼料等，變廢為寶，減少環境污染。許多微生物能產生角蛋白酶，如鏈霉菌、單胞菌、芽孢桿菌等。

本發明的目的在于提供一株產角蛋白酶的金色鏈霉菌，并初步研究了其粗酶性質。

發明內容

角蛋白酶產生菌株的篩選、鑒定、培養條件優化等方法如下：

（1）平板初篩：從江南大學附近農村羊圈采集土壤樣品，取1g土樣添加到10ml生理鹽水中，制備土壤懸液，稀釋涂布至初篩培養基平皿中，?30℃培養3d。在分離平板上挑取能生長的較大的單菌落，劃線分離至單菌落。

（2）搖瓶復篩：初篩得到的菌株經搖瓶發酵，測定其上清液角蛋白酶活力，發現13號菌酶活力較高。

（3）菌株16S?rDNA鑒定：提取總DNA，用細菌16S?rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500?bp，經測序比對，為金色鏈霉菌(Streptomyces?aureofaciens)，命名為K13，于2013年8月19日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.8047?。

（4）菌株發酵條件初步優化：利用單因素及正交實驗對菌株的發酵培養基及發酵條件進行優化，得到最適培養基配方為羊毛0.5-1%，葡萄糖4-8%，蛋白胨3-5%，硝酸鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.04%，氯化鈉0.05%，搖床培養條件為：初始pH值為10.0，接種量10%，培養溫度30℃，搖床轉速220r/min，裝液量30ml/250ml，發酵周期64h，產角蛋白酶活力達到44.2U/ml。

（5）粗酶性質研究：分別研究了作用溫度和作用pH對該酶活力的影響，發現該角蛋白酶的最適作用溫度為50-60℃，最適pH?為8.5，且該酶在堿性(pH7.0-10.0)環境中酶活力穩定（±10%）。該酶為中溫堿性角蛋白酶。

（6）角蛋白酶活力的測定方法：取一18ml試管，依次加入粗酶液(發酵上清液)1.0ml、0.05mol/l的pH?Tris-HCl緩沖液2.0ml、羊毛粉底物10mg，37℃恒溫振蕩水浴鍋反應1h，加入0.4mol/l的三氯乙酸2.0mL終止反應，離心取上清液于280nm測定其吸光值。以37℃恒溫振蕩前添加三氯乙酸的反應管作對照。

酶活力定義：在上述反應體系中，280nm下的吸光度值增加0.01個單位為1個酶活力單位(U/ml)。

其中步驟（1）中所述的初篩培養基為（g/L）：羊毛粉5，K₂HPO₄?1，NaCl?0.5，瓊脂粉20；步驟（2）中所述的復篩搖瓶發酵培養基為（g/L）：羊毛粉10，K₂HPO₄?0.4，NaCl?0.5。

????本發明所述的Pseudomonas?xanthomarina?DN1為反硝化細菌，可廣泛應用于各種富營養化水體的凈化。?

具體實施方式

實施例1?角蛋白酶產生菌株的篩選與鑒定

1、培養基配方

(1)初篩培養基(g/l)：羊毛粉5，K₂HPO₄?1，NaCl?0.5，瓊脂粉20。

(2)種子液體培養基

高氏培養基(g/l)：可溶性淀粉20，KNO₃?1，NaCl?0.5，K₂HPO₄?0.5，M?gSO₄^.7H₂O?0.5，

FeSO₄·7?H₂O?0.01。

LB?培養基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。