[發(fā)明專利]一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310701008.6
• 申請(qǐng)日: 2013-12-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103740640A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金立方;倪堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紹興文理學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 紹興市越興專利事務(wù)所 33220
• 代理人: 蔣衛(wèi)東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)方法，屬于干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著干細(xì)胞的研究不斷深入，其在疾病治療應(yīng)用價(jià)值也被不斷發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cells，MSCs）是一類來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層的成體干細(xì)胞，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSCs可來(lái)源于骨髓、脂肪、臍帶血、真皮、胎盤等組織；此外與其他干細(xì)胞相比，MSCs容易提取分離、增殖以及基因?qū)耄云湓诩?xì)胞移植治療和基因治療中有很大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)MSCs具有多向分化的潛能，能夠誘導(dǎo)分化為許多不同的組織，歸巢特性，以及免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)于組織修復(fù)和免疫疾病等的治療有很大的作用。已有不少文獻(xiàn)證實(shí)了MSCs對(duì)肝臟疾病積極的治療作用。

然而，MSCs的細(xì)胞治療應(yīng)用依然存在一些問(wèn)題：

（1）MSCs的血清培養(yǎng)存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。血清成分不明確，其中可能含有動(dòng)物攜帶的已知的或未知的病原體,?在臨床應(yīng)用中具有潛在的危險(xiǎn)；

（2）需更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MSCs移植治療的有效性和安全性。雖有一些MSCs移植治療的臨床案例，但數(shù)量少，且缺少對(duì)照。

（3）利用人MSCs作為研究對(duì)象，存在取材不便及安全倫理道德的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性等方面的因素，本發(fā)明提供一種無(wú)血清方式的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。

一種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)方法，以MSC?SFM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子，將骨髓細(xì)胞懸液離心后，在上述培養(yǎng)基中，37℃情況下，以1′10⁴?/cm²細(xì)胞密度進(jìn)行恒溫接種培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：

所述的細(xì)胞外基質(zhì)包括Cell?start和Fibronectin，細(xì)胞因子為10μg/L?bFGF。

所述的MSC?SFM為99%MSC?SFM?+1%Supplement+雙抗。

所述的細(xì)胞外基質(zhì)Cell?start使用前先以1:1000的濃度稀釋于α-MEM，置37℃培養(yǎng)箱沉淀，實(shí)驗(yàn)前吸去上清液，晾干備用。

其中，MSC?SFM為商品化的試劑，公司：invitrogen,?目錄號(hào)：A10675-01；產(chǎn)品全稱：StemPro^??MSC?SFM?XenoFree。

Cell?start：公司：invitrogen,目錄號(hào)：A10142；產(chǎn)品全稱：CELLstart^TMCTS^TM?substrate。

bFGF：堿性成纖維生長(zhǎng)因子。

α-MEM：一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

Fibronectin：纖維連接蛋白。

本發(fā)明以StemPro^??MSC?SFM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這種無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞個(gè)體及集落形態(tài)與有血清培養(yǎng)的具有很大的相似性，但也存在差異，其原理、有益效果以及與有血清培養(yǎng)的差異主要如下：

1.?有血清和無(wú)血清培養(yǎng)的MSCs單個(gè)細(xì)胞均呈典型的梭性，集落呈菊花狀或漩渦狀，與典型的MSCs細(xì)胞形態(tài)和集落特性相符合。血清培養(yǎng)的MSCs貼壁時(shí)細(xì)胞形態(tài)狹長(zhǎng)，鋪展較開(kāi)，在增殖過(guò)程中由于細(xì)胞數(shù)量及緊密度的增加使得個(gè)體細(xì)胞形態(tài)逐漸收縮變短小，集落中各細(xì)胞連接緊密；無(wú)血清培養(yǎng)的MSCs在貼壁時(shí)細(xì)胞形態(tài)短小，鋪展程度不高，而在增殖過(guò)程中逐漸鋪展開(kāi)，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得狹長(zhǎng)，在集落中細(xì)胞與細(xì)胞間連接不緊密。這些差異性可能是由于培養(yǎng)基的不同造成的，但并不影響MSCs的基本生物學(xué)特性。

2.?無(wú)血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系保持了MSCs的干性特征：具有典型的MSCs細(xì)胞和集落形態(tài)，表型特征，及具有脂肪，成骨，軟骨的分化潛能。采用脂肪、成骨、軟骨分化培養(yǎng)液對(duì)無(wú)血清體外擴(kuò)增的MSCs進(jìn)行分化培養(yǎng)，并取分化后細(xì)胞RNA進(jìn)行各分化標(biāo)志基因（Ppar、RUNX2、SOX9）及干性標(biāo)志基因（CD29、CD44）的熒光定量分析，結(jié)果顯示，無(wú)血清體外培養(yǎng)的MSCs也具有向脂肪、成骨、軟骨分化的能力，在分化的過(guò)程中，各分化標(biāo)志基因的表達(dá)能力逐漸增強(qiáng)，干性標(biāo)志基因的表達(dá)能力逐漸減弱。

3.?基于上述兩點(diǎn)，無(wú)血清培養(yǎng)方式解決了常規(guī)有血清培養(yǎng)所存在的安全性、有效性的問(wèn)題，采用本發(fā)明無(wú)血清培養(yǎng)方式，取材更方便，也更符合人性化和倫理道德對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的要求。

附圖說(shuō)明