[發(fā)明專利]小核糖核酸病毒科重組載體和病毒樣顆粒及制備方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310698584.X
• 申請日: 2013-12-18
• 公開（公告）號: CN103710384A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王弋;彭濤;許昱華;馬書智;安鴻;尹海濱
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東華南聯(lián)合疫苗開發(fā)院有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/866;C12N15/66;A61K48/00;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 任琳

1.一種小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將P1/P1op基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的兩個啟動下，所述的P1基因和3C基因均為小核糖核酸病毒科的P1基因和3C基因，所述的P1op基因為小核糖核酸病毒科的P1基因的優(yōu)化基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將P1/P1op基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的P_polh啟動子和P₁₀啟動子下。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小核糖核酸病毒科重組載體，其特征在于，將P1/P1op基因和3C基因分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的P_polh啟動子和P_cmv啟動子下。

4.一種小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，包括權(quán)利要求1至3任一所述的小核糖核酸病毒科重組載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，將P1/P1op基因和3C基因分別分別插入同一桿狀病毒載體質(zhì)粒的P_polh啟動子和P₁₀/P_cmv啟動子下，獲得重組穿梭載體，轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒，感染宿主細(xì)胞，獲得病毒樣顆粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞株。

7.制備權(quán)利要求4所述的病毒樣顆粒的方法：其特征在于，依次包括下述步驟：

1）引物設(shè)計

對pFast-dual質(zhì)粒的P_polh啟動子和P₁₀啟動子分析，設(shè)計3C和P1/P1op基因引物；

2）穿梭載體構(gòu)建

以pFast-dual為載體，采用PCR擴(kuò)增3C和P1/P1op基因，回收片段，采用限制性內(nèi)切酶對片段和pFastBac-dual載體進(jìn)行酶切后，利用回收片段進(jìn)行T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH10a感受態(tài)，得到陽性菌落后，提取質(zhì)粒得到重組的各個穿梭載體；

3）重組桿狀病毒載體構(gòu)建

將上述構(gòu)建好的穿梭載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10bac，選白色陽性菌落，進(jìn)行PCR鑒定，得到陽性克隆，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆后，提取重組桿粒；

4）重組桿狀病毒的包裝

將包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因的重組桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9后，得到包含構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因重組桿狀病毒；

5）重組病毒樣顆粒表達(dá)

培養(yǎng)權(quán)利上述的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白編碼基因，得到構(gòu)建病毒樣顆粒所需的蛋白，所述的構(gòu)建病毒樣顆粒所需蛋白進(jìn)行自行組裝，得到病毒樣顆粒，形成的病毒樣顆粒分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中；

6）重組病毒樣純化

步驟5）中的上清經(jīng)過初步離心去除大的細(xì)胞碎片后，采用切向流濃縮包進(jìn)行濃縮后，經(jīng)過分子篩和離子交換兩步得到純化的VLP免疫樣品。

8.權(quán)利要求4所述的小核糖核酸病毒科的病毒樣顆粒作為人或者動物抗小核糖核酸病毒疫苗的藥物用途。