[發(fā)明專利]一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310697288.8
• 申請日: 2013-12-03
• 公開（公告）號: CN104665955A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高紅昌;趙良才;嚴(yán)志漢;白光輝;胡文弋;程小杰
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: A61D7/00
• 分類號: A61D7/00;A61D1/00;G01N1/28
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于膽紅素腦病的研究技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法

背景技術(shù)

高膽紅素血癥是新生兒臨床常見病癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致致死性的膽紅素腦病或嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。它可危及患兒生命，存活者常遺留手足徐動、眼球運動障礙、聽覺障礙、智力低下等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。迄今，對于膽紅素腦損傷這一嚴(yán)重危害新生兒健康的疾病，國內(nèi)外尚無特異性治療方法，仍以預(yù)防為主。在臨床實踐中，由于技術(shù)及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)等原因，有關(guān)新生兒高膽紅素腦損傷的神經(jīng)遞質(zhì)研究及其病理組織學(xué)檢查不宜在活體獲得，同時其神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制也不明確，因此，必須依靠高膽紅素腦損傷的新生動物腦模型來進(jìn)行深入的研究。

目前，有關(guān)高膽紅素血癥腦損傷的影像學(xué)研究取得了一些進(jìn)展，但存在不足是國內(nèi)膽紅素腦病動物模型基本采用腹腔注射膽紅素液的方法建立動物模型，但血清高膽紅素水平不穩(wěn)定，造模成功率極低，因此亟需探索一種穩(wěn)定的大鼠BE造模方法

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實施例的目的在于提供一種應(yīng)用頸靜脈插管注射膽紅素制作BE模型，大大的提高了造模的成功率及其穩(wěn)定性，可作為該模型制作大力推廣，為今后該疾病的研究提供技術(shù)保障。

本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法，其特征在于，所述應(yīng)用一種新的方法更穩(wěn)定的造模，包括以下步驟：

膽紅素溶液的配制，動物造模；

動物造模0.5小時后，對動物進(jìn)行處理和樣品采集；

取得動物的腦組織，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化；

腦組織萃取及血清樣本的制備；

獲取血清及腦組織中膽紅素濃度的數(shù)據(jù)；

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

進(jìn)一步，膽紅素溶液的配制：

膽紅素溶液的配制(使用前現(xiàn)配)：避光稱取晶體膽紅素20mg溶于1ml0.5M?NaOH溶液中，加入雙蒸水9ml，用0.5M?HCL調(diào)節(jié)pH至8.5即成膽紅素溶液，濃度為3.42mmo／L(2mg／ml)。

進(jìn)一步，動物造模：7日齡新生大鼠，隨機(jī)分為：對照組和模型組；

用醫(yī)用膠帶將小鼠四肢固定在手術(shù)臺上，橡皮圈固定頭部。抽取2％鹽酸利多卡因注射液在小鼠頸正中線偏左(右)約1.5cm處皮下浸潤麻醉。持眼科鑷鈍性分離出頸總靜脈，用血管剪在頸總靜脈上剪一小口，將自制PE管(ID=0.1mm，ED=0.3mm)插入到血管內(nèi)，PE管遠(yuǎn)端接上1ml注射器(錫箔紙包好，避光)，注射少量含肝素的生理鹽水驗證注藥通道通暢后，PE管近心端打結(jié)固定。在已建立的頸靜脈通道上，實驗組緩慢注射上述現(xiàn)配制的膽紅素溶液，對照組注射安慰劑，均以50mg/kg體重劑量(即17μl／g體重)注射，控制注射全時程保持在5-10min并保持注射過程在弱光下進(jìn)行。注完藥立即抽出PE管，打結(jié)頸總靜脈近心端，快速縫合創(chuàng)口，將小鼠放入到暗室內(nèi)避光。

進(jìn)一步，動物處理及樣品收集：

獲取大鼠的血清，用于膽紅素濃度的檢測，斷頭取血完成后，隨即剖開大鼠大腦，迅速分離腦包膜，取出整個腦組織，用于膽紅素濃度檢測的樣本在實驗前均保存在-80℃超低溫冰箱中。

動物處理及樣品收集：

進(jìn)一步，觀察大鼠給藥后形態(tài)學(xué)上的變化：

模型組大鼠在給藥后均出現(xiàn)不同程度皮膚、粘膜黃染，煩躁、翻滾、俯伏狀，對外界刺激反應(yīng)遲鈍；對照組大鼠呼吸平穩(wěn)，無煩躁、翻滾等異常活動，對外界刺激反應(yīng)靈敏。

進(jìn)一步，腦組織形態(tài)學(xué)變化：

模型組腦組織兩側(cè)基底節(jié)區(qū)、海馬和小腦半球可見膽紅素顆粒沉積，呈現(xiàn)核黃染

進(jìn)一步，腦組織萃取及血清樣本的制備：

血液離心后取上層清液，腦組織用冰醋酸萃取后，取上層清液。用于膽紅素濃度的測定。

進(jìn)一步，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析，采用post?hoc?Dunnett’s?two-sided檢驗進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)且僅當(dāng)P值小于0.05時，結(jié)果被認(rèn)為是有統(tǒng)計顯著性差異的。

本發(fā)明通過頸靜脈插管技術(shù)制作膽紅素腦病模型，大大的提高了造模的成功率及其穩(wěn)定性，可作為該模型制作大力推廣，為今后該疾病的研究提供技術(shù)保障。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的應(yīng)用一種應(yīng)用頸靜脈插管制作膽紅素腦病模型的方法流程圖；

圖2是7日齡新生大鼠示意圖

圖3是7日齡新生大鼠頸靜脈插管的示意圖

圖4是注射后，實驗組大鼠示意圖