[發(fā)明專利]一種降解硫酸乙酰肝素及檢測其二糖組成的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310695189.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103713057A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗娟;韓章潤;曾洋洋;蘭瑩;邱培菊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;C07H5/06;C07H1/00;C12P19/14;C12P19/12
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種降解硫酸乙酰肝素及檢測其二糖組成的方法。

背景技術(shù)

硫酸乙酰肝素(Heparan?sulfate，HS)是一類廣泛存在于動物組織基質(zhì)及細胞膜的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)，其與17種蛋白質(zhì)構(gòu)成的蛋白聚糖，主要有黏附蛋白聚糖、纖維蛋白聚糖、糖基磷脂酰肌醇蛋白聚糖、β2蛋白聚糖及CD44等。它們在動物細胞的信號傳導、增生與分化、免疫調(diào)節(jié)、細胞黏附以及神經(jīng)細胞的信息傳遞等方面具有重要的生物學功能。HS糖鏈由氨基葡糖(GlcN)通過α(1→4)糖苷鍵與葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖醛酸(IdoA)連接構(gòu)成二糖重復單元，HS與肝素的主要區(qū)別在于二糖重復單元的硫酸化修飾程度及乙酰化程度不同。HS是自然界中結(jié)構(gòu)最復雜的生物大分子之一，其結(jié)構(gòu)的復雜性和多樣性是其參與各種生命活動的基礎(chǔ)。與肝素相比，HS具有抗栓活性強、抗凝血活性弱的優(yōu)點，因此HS日益引起研究者的興趣。幾乎所有動物組織中均含有HS，目前的HS原料主要取自于動物的肺、胰、脾及十二指腸等，不同來源的HS其結(jié)構(gòu)及藥理作用均有明顯差異。但是由于技術(shù)與試劑的限制，現(xiàn)有二糖組成測定方法亟需改進以推進HS的研究、開發(fā)與應用。

現(xiàn)分析HS二糖組成的方法主要依靠肝素酶。肝素酶是一類來自微生物的裂解酶，如肝素酶I、II和III。這三種酶具有不同的糖結(jié)構(gòu)選擇性，可以使肝素及HS在不同的糖苷鍵處斷裂。將肝素及HS降解成二糖需將三種肝素酶聯(lián)合使用，再通過強陰離子交換柱或反相柱分離酶解得到的不同二糖，與市售的二糖標準品比對保留時間進行定性，再通過各二糖標準品對檢測器響應值和物質(zhì)的量的標準曲線進行定量來確定該多糖的結(jié)構(gòu)。呂慧中等用酶解方法對豬肝組織中的硫酸乙酰肝素進行了二糖分析(呂惠中，于廣利，趙峽，等.豬肝組織中硫酸乙酰肝素的分離純化及二糖組成分析[J].中國生化藥物雜志，2007(5)：297～300)。傳統(tǒng)方法中的酶、強陰離子交換柱和二糖標準品都非常昂貴，酶容易失活、性質(zhì)不穩(wěn)定，檢測步驟繁瑣，而且該方法分析結(jié)果的重復性差。如果樣品中混有其它糖胺聚糖，如硫酸軟骨素，肝素酶不能將其降解，故不能檢測到這一類的雜質(zhì)。所以亟需一種全面、高效、簡單、穩(wěn)定且成本低廉的檢測硫酸乙酰肝素類二糖的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種全面、高效、簡單、穩(wěn)定且成本低的檢測硫酸乙酰肝素的方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種可以最大程度地得到硫酸乙酰肝素二糖的方法。

實現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案是：

1.一種檢測硫酸乙酰肝素二糖組成的方法，包括如下步驟：

(1)用化學降解法將硫酸乙酰肝素降解為二糖

①將硫酸乙酰肝素脫乙酰基，得脫乙酰產(chǎn)物；

②用亞硝酸降解步驟①所得脫乙酰產(chǎn)物；

(2)用衍生試劑衍生硫酸乙酰肝素二糖

將步驟(1)所得二糖濃縮至干并溶解于水中，調(diào)節(jié)pH值為堿性，加入0.5mol/L吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成后用氯仿萃取三次去除未反應的衍生試劑；

(3)用液相色譜(LC)法或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法檢測步驟(2)所得衍生后的硫酸乙酰肝素二糖。

2.一種檢測硫酸乙酰肝素二糖組成的方法，步驟(1)包括用酶解與化學降解結(jié)合的方法將硫酸乙酰肝素降解為二糖

①將硫酸乙酰肝素酶解為硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；

②用亞硝酸降解步驟①所得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖。

3.一種檢測硫酸乙酰肝素二糖的方法，所述的脫乙酰步驟包括：

將硫酸乙酰肝素溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到90-111℃，反應4-20h，反應完成后，凍干，除去N₂H₄得脫乙酰產(chǎn)物；

所述的酶解步驟包括：

向硫酸乙酰肝素中加入含有20mmol/L的鈣離子的肝素酶I、II和III，于37℃水浴中酶解48h，得硫酸乙酰肝素寡糖和二糖；

所述的亞硝酸降解步驟包括：

將脫乙酰產(chǎn)物或硫酸乙酰肝素寡糖和二糖濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5℃條件下反應，調(diào)節(jié)pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5℃條件下反應，加入氨水終止反應，得硫酸乙酰肝素二糖。