[發明專利]一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法

有效

• 申請號: 201310695187.7
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103755823A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張麗娟;曾洋洋;韓章潤;蘭瑩;于廣利;邱培菊
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)檢測硫酸軟骨素混合物中的硫酸角質素

①將硫酸軟骨素混合物脫乙酰反應，得硫酸軟骨素混合物脫乙酰產物；

②用亞硝酸降解步驟①所得脫乙酰產物，得硫酸軟骨素混合物二糖；

③將步驟②所得硫酸軟骨素混合物二糖濃縮至干并溶解于水，調節pH值為堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成后用氯仿萃取三次去除未反應的衍生試劑；

④用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法分析步驟③所得產物；

(2)分離純化硫酸軟骨素混合物中的硫酸角質素

將硫酸軟骨素混合物溶于去離子水，配置成濃度為2-5％(W／V)的水溶液，經陰離子交換柱分離，用不同濃度氯化鈉水溶液洗脫，收集氯化鈉濃度小于1.5mol／L的洗脫液，濃縮、透析、脫鹽后冷凍干燥；

(3)檢測硫酸角質素的含量

①將純化后的硫酸角質素脫乙酰反應，得脫乙酰硫酸角質素；

②用亞硝酸降解步驟①所得脫乙酰硫酸角質素，得硫酸角質素二糖；

③將步驟②所得硫酸角質素二糖濃縮至干并溶解于水，調節pH值為堿性，加入吡唑啉酮類衍生試劑，反應完成后用氯仿萃取三次去除未反應的衍生試劑；

④用液相色譜(LC)法或液相色譜質譜聯用(LC-MS)法分析步驟③所得產物。

2.如權利要求1所述的一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，步驟(1)中所述的脫乙酰反應包括如下步驟：

將硫酸軟骨素混合物溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄·H₂O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到80-105℃，反應4-16h，反應完成后，凍干，除去N₂H₄得硫酸軟骨素混合物脫乙酰產物；

所述的亞硝酸降解包括如下步驟：

將硫酸軟骨素混合物脫乙酰產物濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5℃條件下反應，調節pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5℃條件下反應，加入氨水終止反應，得硫酸軟骨素混合物二糖。

3.如權利要求1所述的一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，步驟(3)中所述的脫乙酰反應包括如下步驟：

將純化后的硫酸角質素溶于含有N₂H₄·H₂SO₄的N₂H₄H₂O溶液中，加熱使其溶解，然后密封加熱到80-105℃，反應4-16h，反應完成后，凍干，除去N₂H₄得脫乙酰硫酸角質素；

所述的亞硝酸降解包括如下步驟：

將脫乙酰硫酸角質素濃縮至干，溶于水中，加入pH為1.5的亞硝酸鈉水溶液，在0-5℃條件下反應，調節pH到4.0，加入pH為4.0的亞硝酸，在0-5℃條件下反應，加入氨水終止反應，得硫酸角質素二糖。

4.如權利要求1至3任意一項所述的一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，步驟(1)和(3)所述的脫乙酰反應步驟中密封加熱的溫度為98℃，反應時間為7h。

5.如權利要求1至3任意一項所述的一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，步驟(1)和(3)所述的脫乙酰反應步驟中硫酸軟骨素混合物或純化后的硫酸角質素與N₂H₄·H₂O溶液的質量體積比(mg／mL)為1∶0.5-1，N₂H₄·H₂O溶液中含10％N₂H₄·H₂SO₄。

6.如權利要求1至3任意一項所述的一種硫酸軟骨素中硫酸角質素的純化與檢測方法，其特征在于，步驟(1)和(3)所述的亞硝酸降解步驟中硫酸軟骨素混合物脫乙酰產物或脫乙酰硫酸角質素的水溶液與亞硝酸鈉水溶液、亞硝酸、氨水的體積比為1∶1∶1∶0.6。