[發(fā)明專利]一種促進(jìn)骨髓再生的Endomucin抗體藥物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310692787.8
• 申請(qǐng)日: 2013-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN103690949A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王群;劉景曄;高俊芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/395
• 分類號(hào): A61K39/395;A61P7/06;C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.Endomucin在制備促進(jìn)骨髓再生的抗體藥物中的用途。

2.一種促進(jìn)骨髓再生的Endomucin抗體藥物，其特征在于：

無色透明溶液的劑型，每支Endomucin抗體劑量為20mg/mL,含140mM?NaCl,0.5mM?EDTA，pH7.4。

3.一種促進(jìn)骨髓再生的Endomucin抗體藥物的制備方法，包括以下步驟：

1）Endomucin基因的克隆、蛋白表達(dá)與純化

采用基因合成的方法制備人Endomucin基因，將人Endomucin全長(zhǎng)基因分別克隆到pGEX-2T載體中，使目的基因接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)；然后應(yīng)用anti-GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose對(duì)GST-Endomucin融合蛋白進(jìn)行純化，采用凝血酶切下GST肽段，獲得純度超過98%的人Endomucin蛋白；

2）Endomucin單克隆抗體的制備與純化

①抗原免疫：選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案，每次將0.5mL，20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞；

②細(xì)胞融合：在免疫結(jié)束后的第14天，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備10mL脾細(xì)胞懸液；將準(zhǔn)備好的SP20骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合劑聚乙二醇；使各種淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞；

③雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化：在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌人Endomucin單克隆抗體的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，用有限稀釋法在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化培養(yǎng)，應(yīng)用ELISA方法篩選出能產(chǎn)生Endomucin單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞；在T100細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，培養(yǎng)條件為37℃,5%CO₂,然后取10mL細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)入850?mL羅氏瓶中進(jìn)一步擴(kuò)增，最后向收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20%二甲基亞砜，在液氮中對(duì)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行凍存；?????④單克隆抗體的大量制備：應(yīng)用CelliGen?Plus生物反應(yīng)器，工作容積14升罐體中間填裝200g的聚酯片載體Cytodex?I；聚酯片載體Cytodex?I是由50%聚酯纖維和50%聚丙烯制備的直徑為6mm的小圓盤，比表面積為120mm²/mm³；攪拌和通氣在固定床的上方，在攪拌中產(chǎn)生負(fù)壓，促使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)聚酯片載體Cytodex?I，以利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳遞；采用連續(xù)灌流方式對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基是CD雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為：溫度37℃，pH7.2，攪拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接種細(xì)胞密度2-3×10⁵/mL，四氣混合系統(tǒng)供氣（氧氣、空氣、氮?dú)狻⒍趸迹辉谂囵B(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)21天后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用Contifuge?Stratos連續(xù)流離心機(jī)進(jìn)行連續(xù)流離心處理，在4℃、12000rpm條件下離心去除細(xì)胞及其碎片，流速80mL/min，離心收獲的上清液是含有人Endomucin單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；

⑤單克隆抗體的純化：

應(yīng)用AKTA?Explorer?100蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行人Endomucin單克隆抗體的親和層析純化；親和層析柱的介質(zhì)為Mabselect?Sure，將人Endomucin單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行親和層析柱純化；柱層析純化的流速是5mL/min，以20mM,pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為平衡柱緩沖液和上樣緩沖液，以4個(gè)柱體積（CV）的平衡緩沖液平衡Mabselect?Sure柱后，將離心收獲的含有人Endomucin單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液調(diào)整為pH7.4后直接上柱，上樣量約是10CV，上樣結(jié)束后以約2CV的平衡緩沖液洗凈未結(jié)合的雜蛋白；以20mM,pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫并收獲Endomucin單克隆抗體，然后以0.1N?NaOH沖洗層析柱4CV，清洗柱中的雜蛋白和再生介質(zhì)，以20%乙醇沖洗層析柱2CV保存柱子；通過一步親和層析柱純化收獲純度超過95%的人Endomucin單克隆抗體；將純化收獲的人Endomucin單克隆抗體溶液應(yīng)用Centramate?Cassette超濾器進(jìn)行超濾濃縮和溶液置換，采用截留分子量10000道爾頓的膜包，超濾緩沖液為pH7.4,140mM?NaCl,0.5mM?EDTA,將Endomucin抗體溶液體系置換為pH7.4,140mM?NaCl,0.5mM?EDTA,按照終濃度20mg/mL進(jìn)行稀釋配制，制備人Endomucin單克隆抗體制劑。