[發明專利]一種誘導動物體外細胞可逆永生化的載體及其應用

有效

• 申請號: 201310692377.3
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103695466A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 侯健;張娜;安曉榮
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/64;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.環形載體A，含有大腸桿菌復制起始區、氨芐青霉素抗性基因，以及表達盒1和表達盒2，其特征在于：所述表達盒1從上游到下游依次包括如下元件：P_tight、hTERT、IVS、IRES、Hyg^r和SV40polyA；所述表達盒2從上游到下游依次包括如下元件：P_CMV、rtTA-Advanced和SV40polyA。

2.根據權利要求1所述的環形載體A，其特征在于：所述大腸桿菌復制起始區的序列為序列表中序列1的第7611-8254位；所述氨芐青霉素抗性基因的序列為序列表中序列1的第6604-7466位；和/或

在所述表達盒1中，所述P_tight由TRE_mod和P_minCMV△組成；所述TRE_mod的序列如序列表中序列1的第2-251位所示；所述P_minCMV△的序列如序列表中序列1的第257-316位所示；所述hTERT的序列如序列表中序列1的第373-3829位所示；所述IVS的序列如序列表中序列1的第3892-4177位所示；所述IRES的序列如序列表中序列1的第4223-4814位所示；所述Hygr的序列如序列表中序列1的第4838-5869位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第6199-6399位所示；和/或

在所述表達盒2中，所述P_CMV的序列如序列表中序列1的第10512-9921位所示；所述rtTA-Advanced的序列如序列表中序列1的第9823-9077位所示；所述SV40polyA的序列如序列表中序列1的第9054-8621位所示。

3.根據權利要求1或2所述的環形載體A，其特征在于：所述表達盒1的核苷酸序列為序列表中序列1的第2-6399位；和/或

所述表達盒2的核苷酸序列為序列表中序列1的第10512-8621位。

4.根據權利要求1-3中任一所述的環形載體A，其特征在于：所述環形載體A的核苷酸序列為序列表中序列1。

5.權利要求1-4中任一所述的環形載體A的制備方法，包括如下步驟：

（1）用XhoⅠ酶切pTet-On?Advanced質粒，回收4.2kb片段；用XhoⅠ酶切pTRE-Tight質粒，回收0.6kb片段；將所述4.2kb片段與所述0.6kb片段反向連接，得到重組載體，記作pTet-On?Tight；

（2）用XbaⅠ和NheⅠ酶切pIREShyg3質粒，回收2.3kb片段；用NheⅠ酶切所述pTet-On?Tight，回收線性載體骨架片段，記為片段A；將所述2.3kb片段與所述片段A正向連接，得到重組載體，記作pTet-On?IREShyg；

（3）用EcoRⅠ酶切pLPC-hTERT質粒，回收3.4kb片段；將所述3.4kb片段的末端補平，得到平齊末端片段；用Eco47Ⅲ酶切所述pTet-On?IREShyg，回收線性載體骨架片段，記為片段B；將所述平齊末端片段與所述片段B正向連接，得到重組載體，記作pTet-On?hTERT；所述pTet-On?hTERT即為權利要求1-4中任一所述的環形載體A。

6.權利要求1-4中任一所述的環形載體A在誘導動物體外細胞可逆永生化中的應用。

7.用于誘導動物體外細胞可逆永生化的組合物，由權利要求1-4中任一所述的環形載體A和強力霉素組成。

8.環形載體B，為權利要求1-4中任一所述的環形載體A缺失權利要求1-4中任一所述的hTERT后形成的環形載體。