[發(fā)明專利]一種基于新型納米復合材料的蛋白質組樣品預處理方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310691027.5
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN104713963B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 張麗華;鄧楠;江波;陳遠波;吳琪;楊開廣;梁振;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司21002
• 代理人: 劉陽

技術領域

本發(fā)明涉及蛋白質樣品預處理方法，具體地說是一種基于聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物的制備及其在蛋白質樣品預處理中的應用。

背景技術

生物樣品內蛋白質的組成極其復雜，而且動態(tài)范圍比較寬，濃度差異大（豐度差異大），比如血漿樣品中前10種高豐度蛋白質含量占到總蛋白質含量的90%，前22種蛋白質占到99%，余下幾千種蛋白卻僅占到1%，高豐度蛋白質的存在會掩蓋低豐度蛋白質，從而干擾對低豐度蛋白質的鑒定，而這些低豐度蛋白質往往存在潛在的生物學意義，在疾病標志物的發(fā)現與治療方面可能會發(fā)揮重要生物功能（J.Proteome?Res.,2011,10,516）。因此在蛋白質樣品分析過程中需要降低其中高豐度蛋白質的豐度差別，縮小這種差異以方便用現有的檢測技術檢測到低豐度蛋白質成為蛋白質樣品預處理的核心問題之一。

目前發(fā)展的去除高豐度蛋白質的技術方法主要包括染料配體法、超速離心過濾法、免疫去除法及預分級技術。染料配體法是將汽巴藍F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯顆粒表面，通過染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白(Journal?of?Chromatography?B,2006,832,216-223)。該方法樣品的處理量大，但特異性較差。超速離心過濾法主要通過選擇具有不同截留分子量的膜實現蛋白質的分離，并去除某些分子量較大的高豐度蛋白質（Molecular&Cellular?Proteomics,2003,2,10961103）。然而高豐度蛋白質并非都是大分子量的蛋白質，因此會存在對高豐度蛋白質去除不充分，而且可能會同時去除高分子量的低豐度蛋白質等問題。與前兩種去除方法相比，免疫去除法的特異性很高(Mol?Cell?Proteomics2008,7,1963-1973;J?Proteome?Res2010,9,4982-4991;J?Proteome?Res.,2007,6,947-954)。然而，該方法仍存在很多不足，如，低豐度蛋白質易與部分高豐度蛋白質非特異性結合，產生共去除現象(Electrophoresis2010,31,471-482)；已發(fā)現的抗體種類少(20種)；處理樣品的體積有限；去除后的樣品被稀釋；不同蛋白質去除效率有一定差異性等。近期，人們還通過采用液相等電聚焦和多維液相色譜等方法進行樣品的預分級，有效地降低了樣品的復雜程度(J.ProteomeRes.,2009,8,11431155;Electrophoresis,2009,30:249-261;Electrophoresis,2010,31,35803585;J.Proteome?Res.,2009,8,11431155;J.Proteome?Res.,2010,9,1902-1912)。但是液相等電聚焦方法只能根據已有的等電點膜將樣品按照有限的等電點區(qū)間進行分級。因此，高豐度蛋白質所在級分仍存在對低豐度蛋白質的掩蓋問題。而多維液相色譜方法不僅操作繁瑣、運行時間長，而且也難以避免去除高豐度蛋白質的同時造成低豐度蛋白質的共洗脫。

發(fā)明內容

針對以上方法目前存在的不足，本發(fā)明提供一種簡便高效的蛋白質樣品處理方法以降低蛋白質樣品的復雜程度。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

在不同pH條件的緩沖溶液中，采用聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒處理蛋白質組樣品，以降低蛋白質組樣品中高豐度蛋白質的豐度，并同時實現蛋白質組樣品復雜程度的降低。

所述聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒的制備與蛋白質樣品處理的具體步驟如下，

（1）樣品處理方法中所述的材料聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒的制備：將氧化石墨烯分散于水中，超聲使其分散均勻。加入與氧化石墨烯質量比為10-1000倍的聚亞乙基亞胺（PEI），室溫震蕩反應5min-70min后，加入與聚亞乙基亞胺質量比為1/5-1/100的氯金酸（HAuCl43H₂O），震蕩均勻，30-100℃反應5-90min。雙蒸水反復洗滌后，離心并分散于100μL水中。向200-500μL上述顆粒中加入25-100mg?SH-PEG溶液，水溶液體系中反應2-24h，水洗滌即制得聚乙二醇修飾的聚乙烯亞胺偶聯的納米金修飾氧化石墨烯納米復合物顆粒。

（2）體液樣品包括血液和尿液樣品；組織樣品包括動物組織樣品如動物大腦、心臟、肺、胃、肝臟等組織樣品；細胞樣品如Hela細胞樣品、類淋巴母細胞等細胞株樣品。