[發明專利]一種檢測丙肝核心抗原的標記物及試劑

有效

• 申請號: 201310690679.7
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103675280A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 甘宜梧;葉麗華;譚柏清
• 申請（專利權）人: 山東博科生物產業有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

技術領域????

本發明涉及丙肝檢測技術領域，特別涉及一種檢測丙肝核心抗原的標記物，還涉及一種檢測丙肝核心抗原的試劑。

背景技術???

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(?HCV)?感染引起的一種重要的傳染病，主要通過血液傳播。多數HCV?感染并無癥狀，感染丙肝病毒后形成慢性感染機率高，多數患者會發展成肝硬化、肝癌。為此，感病后早檢出丙肝病毒感染，及時有效的阻斷HCV?的傳播是非常重要的。

檢測丙型肝炎病毒（Hepatitis?C?virus，HCV）核心抗原可以直觀地反映出HCV?的感染狀況，并有效縮短HCV?感染的檢測窗口期。但由于人在感染后，核心抗原在血液中存在的時間短且含量低，采用高靈敏的方法檢測來提高準確性。?

在免疫分析方法中，抗原或抗體標記物不僅決定免疫分析方法的分類，而且也決定免疫分析的靈敏度及特異性。傳統的標記物為辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體，應用酶上的氨基、巰基或糖蛋白上的羥基作為交聯基團，通過過碘酸鈉將抗原或抗體與酶直接連接在一起。抗原抗體反應信號通過HRP?催化底物來顯現。一般1個抗原或抗體分子上僅能連接1～2?個HRP分子，檢測靈敏度低。?

發明內容???

為了解決以上現有技術中存在的抗原或抗體標記物靈敏度及特異性差的問題，本發明提供了一種增加檢測的靈敏度、有效縮短檢測的窗口期的檢測丙肝核心抗原的標記物。

本發明還提供了含有上述標記物的檢測丙肝核心抗原的試劑。?

本發明是通過以下措施實現的：?

一種檢測丙肝核心抗原的標記物，含有摩爾比為20∶1的辣根過氧化物酶與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物。

所述的標記物，通過以下步驟得到的：?

（1）經活化的辣根過氧化物酶，與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物混合，室溫條件下反應2-2.5h，經封閉液處理后分離未連接的辣根過氧化物酶，收集第1?洗脫峰，為L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸與HRP的結合物，加入10％體積的10mg／mL?EMCS（3-（N-嗎啡啉）丙磺酸鈉鹽），室溫反應2.5h洗脫得結合物；

（2）取純化的單抗，調整濃度至5.0mg/mL，每毫升中加入6.0mgβ-巰基乙胺，37℃保溫90min，并洗脫還原，將還原的抗體與結合物按照質量比1∶1的比例混合，4℃避光反應24h，洗脫，收集第1峰，即得。

所述的標記物，優選步驟（2）中洗脫為過Superdex?200?分子篩層析柱。?

一種檢測丙肝核心抗原的試劑，含有上述的檢測丙肝核心抗原的標記物。?

所述的試劑，還含有緩沖體系和顯色劑。?

目前，HCV?核心抗原檢測是診斷HCV?感染的新方法，與HCV?抗體檢測比較，能縮短HCV?檢測的窗口期，但由于HCV?出現在血清中有一定的時限，且含量低，因此需要靈敏度較高的檢測方法。標記物為免疫檢測中的重要成分，本研究在HCV?檢測中抗原、抗體不變的情況下，通過改進標記物進而提高了檢測的靈敏度。本研究的標記物也可應用于其他免疫檢測中，如果與靈敏度更高的化學發光或免疫熒光法結合，則可以檢測更微量的物質。?

本研究所制備的聚合物標記物的每個標記物上可連接多個抗體分子，同時在HRP的外圍或多聚多肽上連接數個抗體分子。采用雙抗體夾心酶聯免疫法檢測丙型肝炎病毒核心抗原，配以陰陽對照以及顯色劑等試劑，定性檢測人血清樣品中丙型肝炎病毒核心抗原。該系統驗證結論的同時，具有耗時短、試劑穩定性好、無污染等優點。?

本發明的有益效果：?

以L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物為載體使抗體與HRP?連接在一起，反應信號可通過連接的HRP?催化底物系統而體現，因此，檢測的靈敏度大幅提高。利用該方法將HCV?核心抗原單克隆抗體與HRP偶聯，進而增加抗體與HRP?的比率，增加檢測的靈敏度，有效縮短檢測的窗口期。

具體實施方式

為了更好的理解本發明，下面結合具體實施例來進一步說明。?

實施例1：

一種檢測丙肝核心抗原的標記物，是通過以下步驟得到的：

（1）活化的辣根過氧化物酶HRP，與L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸聚合物按照20∶?1的摩爾比混合，室溫條件下反應2h，經封閉液處理后分離未連接的HRP，收集第1?洗脫峰，為L-賴氨酸羧甲基半胱氨酸與HRP的結合物，加入10％體積的10mg／mLEMCS，室溫反應2.5?h洗脫得到結合物；