[發明專利]利用對蝦原代細胞篩選抗白斑綜合征病毒中草藥的方法

無效

• 申請號: 201310689811.2
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN103695563A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 王印庚;國子娟
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/02;C12R1/93
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李素紅

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種利用對蝦原代細胞篩選抗白斑綜合征病毒中草藥的方法。

背景技術

經過近30年的快速發展，對蝦養殖業已成為我國農村經濟的重要組成部分，在提高沿海地區農漁民就業和經濟收入方面發揮了重要作用。但是，隨著養殖規模的不斷擴大和環境的惡化，對蝦病害問題也日趨嚴重，病原種類繁多，而其中危害最嚴重的是對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)。該病毒自1992年爆發以來，已在世界范圍內傳播開來，每年給對蝦養殖業造成巨大經濟損失。僅1993至1994年，使我國的對蝦養殖業大幅度減產，每年損失數十億元。對蝦白斑綜合征的蔓延不僅使我國養蝦業嚴重受傷，而且已在日本、泰國、越南、馬來西亞、印度等國家和地區造成嚴重危害，使之成為世界性問題。1995年該病毒被國際獸疫局、聯合國糧農組織以及亞太地區水產養殖發展網絡中心列為需要報告的水生動物病毒性疫病之一。該病毒發病快、死亡率高、傳播迅速，逐漸成為制約對蝦養殖業發展的主要因素。目前，由于沒有有效的藥物來防治WSSV，因此控制對蝦白斑綜合征的方法主要在于選取優良品種、供給優質餌料、加強水質管理等措施。

中草藥具有良好的抗病毒作用，可以直接抑制或滅活病毒，但對動物機體副作用小，且可以調節免疫功能，增強動物的抗病能力，具有良好的臨床應用前景。并且，中草藥在魚蝦等水生動物一些病毒性和細菌性疾病上取得了良好的防治效果。

然而，在養殖生產實踐中中草藥存在盲目使用的問題，未經過認真、科學的篩選，亂用藥物的情況普遍存在。水產上用到的中草藥配方多源自人類醫學或通過活體生物試驗法總結而得。迄今為止，水生動物中還沒有通過細胞進行抗病毒藥物篩選的報道。本技術方法，應用體外培養的對蝦原代細胞進行抗WSSV中草藥的篩選，具有快速和高通量篩選的特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種利用對蝦原代細胞篩選抗WSSV中草藥的方法，篩選出具有抗病毒作用的單方或者復方中草藥，解決目前在防治對蝦白斑綜合征病毒方面尚無全面有效治療藥物的現實問題，控制對蝦WSSV蔓延的局面，為實現對蝦健康養殖提供技術保障。

本發明所采取的技術方案是：

一種利用對蝦原代細胞篩選抗白斑綜合征病毒中草藥的方法，將純化的對蝦白斑綜合征病毒與中草藥相互作用，使中草藥直接作用于對蝦白斑綜合征病毒，所述中草藥作用后的對蝦白斑綜合征病毒接種體外培養的對蝦原代細胞，，觀察細胞的病理變化（CPE），從而篩選出具有抗對蝦白斑綜合征病毒作用的中草藥種類。

進一步，所述的體外培養的對蝦原代細胞是對蝦類淋巴組織遷出的單層細胞，且淋巴組織是WSSV的易感組織。

進一步，在所述的中草藥與WSSV相互作用之前，將純化的對蝦白斑綜合征病毒粒子通過10倍梯度稀釋，確定使細胞出現CPE的最低病毒濃度；設置不同濃度梯度的中草藥藥液，確定其作用于細胞的最大安全濃度。

進一步，所述的中草藥直接作用于WSSV24-36h后，再把所述的中草藥與WSSV的混合液接種體外培養的對蝦原代細胞。

淋巴細胞感染WSSV24h后開始出現CPE，主要表現為細胞停止延伸，出現亮圓顆粒，貼壁細胞逐漸漂浮，細胞之間的網狀結構消失，最后細胞破碎、溶解；有抗病毒作用的中草藥能抑制WSSV對淋巴細胞的殺傷作用，細胞生長狀態良好，細胞結構完整。根據以上原理，判斷中草藥是否具有抗WSSV的作用。

本發明與現有技術相比的有益效果：

1、本發明以體外培養的對蝦原代細胞為載體，不僅最大限度的模擬了動物體內的生理過程和環境，增加了篩選結果的真實性和準確性，使結果更接近臨床效果。并且可以建立較大規模的中草藥篩選模型，具有快速和高通量篩選的特點。

2、本發明與動物實驗法相比，避免了對蝦養殖的季節性，也不必浪費大量的實驗對蝦，操作方便，節約成本，大大提高了篩選的效率。換言之，本技術方法僅需要WSSV敏感的對蝦組織，而不需要大量、昂貴的活體對蝦進行實驗。

3、本發明將中草藥與病毒粒子混合后作用于對蝦原代細胞，使中草藥直接抑制或滅活病毒，避免了中草藥直接作用于細胞產生的假陽性結果。

4、本發明可以直接通過倒置顯微鏡觀察中草藥對WSSV的藥物作用和滅活病毒效果。

附圖說明

圖1.刀額新對蝦淋巴組織原代細胞的光鏡圖片

A,B,C,D分別表示對蝦淋巴組織原代細胞生長12h，24h，48h，72h

圖2.純化的WSSV經負染后的電鏡圖片

A.病毒核衣殼?B.完整的病毒粒子