[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于糖絲菌的PCR引物及檢測(cè)糖絲菌的方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310689164.5
• 申請(qǐng)日: 2013-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103614488A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梅海;郝純;李雪;張勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)（北京）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于糖絲菌的PCR引物及檢測(cè)糖絲菌的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

糖絲菌屬細(xì)菌屬于放線菌目假諾卡氏菌科，是一類(lèi)好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，大多數(shù)糖絲菌能在沙漠中廣泛生長(zhǎng)。糖絲菌具有一個(gè)相對(duì)快速和簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)周期，可作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行科學(xué)研究。

糖絲菌具有重要的應(yīng)用價(jià)值，分離到的多株糖絲菌能生產(chǎn)多種強(qiáng)效抗菌素。另外糖絲菌能夠以蒽、菲、芘為惟一碳源和能源，降解及利用一些環(huán)境污染物及有機(jī)物如烷烴。因此糖絲菌越來(lái)越為人們所關(guān)注。

現(xiàn)有技術(shù)中，有兩種常用的對(duì)糖絲菌進(jìn)行鑒定的方法：

1、生理生化指標(biāo)鑒定。此方法是目前許多生化實(shí)驗(yàn)室常用的方法，此方法需要得到菌株的純培養(yǎng)物，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受人為觀察影響因素較大，準(zhǔn)確性不高。

2、提取菌株DNA進(jìn)行測(cè)序。目前是用16SrRNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。此方法結(jié)果比較準(zhǔn)確。但仍需要得到菌株的純培養(yǎng)物，無(wú)法從混合樣品中快速鑒定是否含有假單胞菌。

因此本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)出一種能夠快速、準(zhǔn)確判定糖絲菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)鑒定糖絲菌試驗(yàn)

周期長(zhǎng)、適用范圍窄的不足，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確、方便，可對(duì)混合樣品如土壤、海底沉積物、水中是否含有糖絲菌進(jìn)行快速判定的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)發(fā)明人設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)糖絲菌16SrDNA基因部分片段的PCR引物，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物：Sac-F：5’-GCGGTTTGTTGCGTCGG-3’（如SEQ?ID?No.1所示），Sac-R：5’-TAGCACCCACCGTTTACG-3’（如SEQ?ID?No.2所示）。

所述16S?rDNA基因是指基因組中編碼16S核糖體RNA（rRNA）分子的對(duì)應(yīng)的DNA序列，也就是編碼16S?rRNA的基因，本發(fā)明所述引物的16S?rDNA目的基因具體如下：

GAGGCAGACCTCGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTGTACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTAGGTCTAATACCGGATATGACTCCACTAGGCATCTTGTGGGGTGGAAAGTTCCGGCGGTACAGGATGGACCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCACCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAAGCGGTTTGTTGCGTCGGCTGTGAAAACTTCACGCTTAACGTGGAGCCTGCAGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGCGTAGCGGTGAAATGCGCAGATACCACGACGAACGCCGGTGGGGAAGGCGGGGCT（如SEQ?ID?No.3所示）。

本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“引物”指作為合成引物延伸產(chǎn)物的起始位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸序列，其與待復(fù)制的核酸鏈互補(bǔ)，長(zhǎng)度和序列必須適合于延伸產(chǎn)物的合成。引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3′端開(kāi)始合成新的核酸鏈。體外人工設(shè)計(jì)的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測(cè)序和探針合成等。

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測(cè)糖絲菌的試劑盒，包含用于擴(kuò)增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)糖絲菌的方法，包含以下步驟：

步驟1：配制PCR反應(yīng)體系，94℃預(yù)變性10分鐘進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)完畢后72℃延伸10分鐘；所述PCR反應(yīng)體系中上游引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所示；