[發明專利]重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 201310689151.8
• 申請日: 2013-12-17
• 公開（公告）號: CN103773772A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 仇雪梅;徐進;王秀利;姜志強;高長富
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/46
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征按如下步驟進行：

a.?以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進行PCR擴增；所述引物pETF19/pETR19序列如下：

pETF19：5’-GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’；pETR19：5’-TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3’；

b.?以a步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進行PCR；所述引物76F20序列如下：

5’-AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’；

c.?以b步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進行PCR擴增；所述引物50F21序列如下：

5’-TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’；

d.?以c步驟反應產物的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進行PCR擴增，所述引物25F21序列如下：

5’-ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’；

e.?以d步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物NcoIF/XhoIR進行PCR擴增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下：

上游引物NcoIF：5’-CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’；

下游引物XhoIR：5’-CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’；

f.?電泳回收e步驟PCR產物與克隆載體pMD19T連接，轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養，通過藍白斑篩選陽性克隆，選擇120bp?大小的條帶進行回收；

g．用限制性內切酶NcoI和XhoI分別雙酶切f步驟所回收產物的質粒和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用T4?DNA連接酶連接，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5α進行培養并篩選提取重組表達質粒；

h．將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態細胞內，挑取單克隆經IPTG誘導后收集菌體；

i.?將收集的菌體用pH8.0、0.5M?Tris-HCl緩沖溶液重懸，進行超聲波破碎，離心取上清，過Ni-TNA柱純化，收集洗脫液；

j.?將洗脫液透析，獲得重組表達蛋白。

2.根據權利要求1所述重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征在于：

????所述a步驟的PCR反應條件為：94℃預變性?5min，94℃變性?30s，56℃復性30s、72℃延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存；

????所述b步驟的PCR反應條件為：94℃預變性?5min，94℃變性?30s，58℃復性30s、72℃延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存；

????所述c步驟的PCR反應條件為：94℃預變性?5min，94℃變性?30s，59℃復性30s、72℃延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存；

????所述d步驟的PCR反應條件為：94℃預變性?5min，94℃變性?30s、60℃復性30s、72℃延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存；

????所述e步驟的PCR反應條件為：94℃預變性?5min，94℃變性?30s，55℃復性30s、72℃延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存。