[發明專利]鴿圓環病毒的LAMP檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310687257.4
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103667536A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 杜改梅;劉茂軍;陳熠夕;羅碧平;胡志華;晏文梅;蔣加進;戴鼎震
• 申請（專利權）人: 金陵科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬衛生檢驗領域，涉及一種鴿圓環病毒的LAMP檢測試劑盒。

技術背景

鴿圓環病毒（Pigeon?circovrius，PiCV）是一種免疫抑制性病原。鴿圓環病毒感染是一種接觸性傳染病和免疫抑制病，主要侵害幼鴿。鴿子感染后主要表現為昏睡、嗜眠、厭食、體重減輕、呼吸窘迫等癥狀，嚴重時甚至出現死亡，給養鴿業帶來巨大的經濟損失。該病于1993年首次報道于美國加利福尼亞，同年南非也發現本病，此后，在加拿大、德國、比利時、意大利以及法國等多個國家均有感染報道。我國也有幼齡賽鴿和肉鴿圓環病毒感染的報道，患鴿主要表現為倦怠、消瘦、呼吸紊亂、腹瀉和競技能力下降等。

目前，鴿圓環病毒還沒有受到廣泛的關注，有關研究報道較少。在檢測方面，國內外已有PCR檢測方法的相關報道，該方法雖然靈敏度高，但確存在著檢測時間長、操作繁瑣、需要精良設備等諸多弊端，不適合用于臨床檢測。因此，建立一種快速、敏感和方便的檢測方法將是防控該病的關鍵。

環介導等溫擴增技術（LAMP）是由T.Notomi(2000)發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴4條特異設計的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。今年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體的檢測。Masaki?Imai等人（2007）利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；Nobuyuki?Hayashi等人（2007）針對四種香酒酵母的ITS序列設計了LAMP特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以用于檢測其他與人類相關的病毒，如病毒性出血性敗血癥（VHS）、巨細胞病毒（CMV）、造血組織壞死病毒（IHHNV）、番茄黃化曲葉病毒等。LAMP還可以用于對動物早期胚胎性別鑒定等。目前國內外均未見有用于檢測鴿圓環病毒的LAMP試劑盒。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種使用方便、敏感度高、鑒定簡便的鴿圓環病毒的LAMP檢測試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

鴿圓環病毒的LAMP檢測試劑盒，它包括如SEQ?ID?No：1～4所示的核苷酸序列或者SEQ?ID?No：5～8所示的核苷酸序列。

上述鴿圓環病毒的LAMP檢測試劑盒，優選包括：

（1）LAMP反應液：每24μL?LAMP反應液的配制比例為：10×ThermoPol?buffer2.5μL、100mM?MgSO₄0.5～1.5μL、8M?Betaine0.5～2.0μL、10mM?dNTPs1.5～3.0μL、10μM上游引物F30.25～1.5μL、10μM下游引物B30.25～1.5μL、40μM內上游引物FIP0.25～1.5μL、40μM內下游引物BIP0.25～1.5μL、8U/μL?Bst?DNA聚合酶大片段0.5～2.0μL、用滅菌ddH₂O補至24μL；

（2）陽性模板：鴿圓環病毒陽性脾臟DNA；

（3）核酸染料：SYBR?Green?I；

其中，上游引物F3、下游引物B3、內上游引物FIP、內下游引物BIP的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No：1～4所示，或者分別如SEQ?ID?No：5～8所示。

其中，所述的LAMP反應液，每24μL?LAMP反應液的優選配制比例為：10×ThermoPol?buffer2.5μL、100mM?MgSO₄1.0μL、8M?Betaine1.5μL、10mM?dNTPs2μL、10μM上游引物F30.5μL、10μM下游引物B30.5μL、40μM內上游引物FIP0.5μL、40μM內下游引物BIP0.5μL、8U/μL?Bst?DNA聚合酶大片段1.5μL、用滅菌ddH₂O補至24μL。

上述的上游引物F3、下游引物B3、內上游引物FIP、內下游引物BIP分別為1F3（SEQ?ID?No：1）、1B3（SEQ?ID?No：2）、1FIP（SEQ?ID?No：3）、1BIP（SEQ?ID?No：4）組成的第一套引物，或2F3（SEQ?ID?No：5）、2B3（SEQ?ID?No：6）、2FIP（SEQ?ID?No：7）、2BIP（SEQ?ID?No：8）組成的第二套引物，所述1F3、1B3、1FIP、1BIP或2F3、2B3、2FIP、2BIP的序列見表1。表中的排序序號中的1～4為第一套引物，5～8為第二套引物。

表1