[發明專利]一種診斷類風濕關節炎的microRNA分子標志物及其檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310686940.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103805696A
• 公開（公告）日: 2014-05-21
• 發明（設計）人: 焦志軍;王文紅;張瑩瑩;朱波
• 申請（專利權）人: 焦志軍;王文紅;張瑩瑩
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物技術診斷領域，涉及用于診斷類風濕關節炎的9種microRNA分子標記物組合及其應用。?

背景技術

類風濕關節炎(Rheumatoid?arthritis；RA)是一類慢性，系統性的自身免疫性疾病，其主要病理改變為關節滑膜明顯增厚并有大量炎癥細胞浸潤，血管翳形成以及軟骨組織的侵蝕與破壞。一直以來，類風濕因子和抗環瓜氨酸蛋白抗體是美國風濕病協會診斷標準中的血清學指標，但敏感性和特異性均不高。目前仍不能闡明RA的發病機制及對疾病進行預測，因此找出疾病早期診斷和監測病程的生物標志物顯得十分重要。?

miRNA是一類長度約為22個核苷酸，參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子RNA，具有高度保守性、時序性和組織特異性。由于miRNA參與機體的各種重要的生理和病理過程，近年來倍受關注。miRNA的出現讓人們在對哺乳動物基因組的表達和功能的認識上發生巨大的改變。目前通過不同的實驗方法和計算機檢測已經證實了在193個物種中存在25141個成熟miRNA(miRBase?database，version19.0，August，2012)，到目前為止，在數據庫中已經有1223個人類miRN。據估計，一個miRNA可能調控幾百到幾千個靶基因，因此大約30％-90％的人類基因受到miRNA的調節。miRNA的表達和功能對于不同生理系統的發育和細胞穩態以及機體功能的維持具有重要的作用，尋找疾病診斷的標志物對其準確診斷一直是醫學研究領域的重點。miRNA可被分泌釋放到細胞外，參與多種炎性和自身免疫性疾病的發病過程。組織細胞內外的miRNA表達圖譜的差異使miRNA作為疾病診斷的潛在性生物標志。?

發明內容

本發明的目的在于介紹一種用于檢測RA的miRNA標志物組合，通過在miRNA的3’端加上一特異性的莖環引物，通過逆轉錄和熒光定量PCR的方法檢測被檢樣本血漿中這些miRNA的含量，并與正常人血漿中相應miRNA的水平比較來診斷RA。?

為實現上述目的，本發明的技術方案是：一組用于檢測RA的miRNA標志物組合，為：miR-9-5p(5’-ucuuugguuaucuagcuguauga-3’，SEQ?ID?NO.1)、miR-122-3p(5’-aacgccauuaucacacuaaaua-3’，SEQ?ID?NO.2)、miR-219-2-3p(5’-agaauuguggcuggacaucugu-3’，SEQ?ID?NO.3)、miR-4634(5’-cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQ?ID?NO.4)、miR-181d(5’-aacauucauuguugucggugggu-3’，SEQ?ID?NO.5)、miR-342-3p(5’-ucucacacagaaaucgcacccgu-3’，SEQ?ID?NO.6)、miR-4764-5p(5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQ?ID?NO.7)、miR-3926(5’-uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQ?ID?NO.8)、miR-3925-3p(5’-acuccaguuuuaguucucuug-3’，SEQ?ID?NO.9)。?

本發明的優點是：篩查出的miRNA的標志物組合用于診斷RA的特異性和靈敏度高。?

miRNA標志物組合通過以下步驟得到：?

第一步：芯片篩選：選取臨床確診的初發活動期的RA患者5例，健康體檢者5例各采?集血漿1ml以上使用miRCURY^TM?LNAArray(version18.0)進行表達譜芯片篩選，得出在RA患者血漿中差異性表達的33種miRNA，其中22種miRNA升高，11種miRNA降低。?

第二步：定量PCR初篩：選取臨床確診的RA患者18例，健康體檢者14例，通過逆轉錄和熒光定量PCR的方法檢測芯片篩選得出的33種差異性表達的miRNA，經過第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初篩得出22種miRNA。?

第三步：定量PCR驗證：選取臨床確診RA患者57例，健康體檢者56例，使用上述相同的檢測方法，通過差異性分析找出9種在RA患者血漿中差異性表達的miRNA。這九種miRNA的組合在診斷RA的特異性和靈敏度高。?

本發明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的檢測試劑盒?

技術方案是：一種類風濕關節炎的診斷試劑盒，包括以下成分：?