[發明專利]一種β-葡萄糖苷酶及其應用

有效

• 申請號: 201310686413.5
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103710326A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 高樂;張東遠;陳樹林
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12R1/885
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術領域

本發明涉及微生物應用領域，特別涉及一種β-葡萄糖苷酶及其應用。

背景技術

生物質轉化為葡萄糖往往需要至少三種不同的酶蛋白的協同作用，外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶，CBH)，作用于纖維素線狀結構的末端，水解β-1，4糖苷鍵，依次從纖維素的末端切下纖維二糖。它可以作用于纖維素的結晶區和無定形區。(2)內切葡聚糖酶(EG)。這類酶作用于纖維素結構內部的無定形區，隨機水解β-1，4糖苷鍵，將長鏈的纖維素截短，產生大量含有非還原性和還原性末端的小分子纖維素。內切葡聚糖酶的作用是為外切酶提供大量的反應末端。(3)β-葡萄糖苷酶(BG)。這類酶將纖維二糖或者短鏈葡聚糖水解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶參與纖維素水解的最后一步，常常被認為是纖維素降解過程的限速酶，也是利用纖維素酶進行高效生物質轉化的主要瓶頸之一。β-葡萄糖苷酶的主要功能有兩個，其一是其可以分解纖維二糖產生葡萄糖，減少了纖維二糖對外切酶和內切酶的產物抑制作用；其二是其可以將葡萄糖進行轉糖基作用合成有誘導作用的二糖物質，如龍膽二糖，槐糖。這些有誘導作用的二糖物質可以促進纖維素酶和半纖維素酶的誘導合成。雖然最常見的β-葡萄糖苷酶(Cel3A)已經被深入研究很多年，但是其轉糖基作用不明顯。為了進一步提高纖維素水解效率，和解析纖維素酶作用機理，亟待發掘新型的β-葡萄糖苷酶。

里氏木霉測序后發現真菌胞外存在七種潛在的β-葡萄糖苷酶，分別為Cel1A，Cel1B，Cel3A，Cel3B，Cel3C，Cel3D和Cel3E。Cel3E是胞外唯一一個沒有被深入研究的β-葡萄糖苷酶，至今從未在真菌胞外粗酶液中分離出來，其酶學性質和生物學功能不明晰清楚。

發明內容

本發明是從檜狀青霉的胞外分離純化得到了新型的β-葡萄糖苷酶，其在纖維素酶誘導，木質纖維素降解方面發揮了獨特的作用。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案為：

一種β-葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種β-葡萄糖苷酶的表達基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

一種如權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，從檜狀青霉胞外粗酶液中分離如權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

優選的是，從真菌胞外粗酶液中提取蛋白質，使用分子篩凝膠層析柱Sephadex?S-200從蛋白質中分離出如權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

優選的是，使用pH值為4.8～5.0的物質的量濃度為18～22mM的醋酸-醋酸鈉溶液，以0.15～0.3mL/min沖洗所述分子篩凝膠層析柱。

一種如權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在誘導纖維素酶產生菌合成纖維素酶和半纖維素酶中的應用。

優選的是，利用β-葡萄糖苷酶將葡萄糖轉化為龍膽二糖和槐糖，以誘導纖維素酶合成，以及利用β-葡萄糖苷酶將木三糖水解為木二糖，以誘導纖維素酶或者半纖維素酶合成。

一種如權利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在提高纖維素酶產生菌胞外纖維素酶糖化水解效率中的應用。

優選的是，所述纖維素酶產生菌為里氏木霉或者檜狀青霉。

本發明的有益效果是本發明是首次從真菌細胞的胞外粗酶液中分離出來，并且是從檜狀青霉的胞外分離純化得到的新型的β-葡萄糖苷酶，本發明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E與底物親和能力極強，比如：以PNPG為底物，PpCel3E?K_m值為0.0019mM，為已報道的真菌胞外β-葡萄糖苷酶K_m最低的。本發明所述β-葡萄糖苷酶在提高產纖維素酶真菌胞外纖維素酶糖化水解效率和在提高里氏木霉或者檜狀青霉胞外纖維素酶糖化水解效率中起到很大的作用。本發明所述β-葡萄糖苷酶通過轉糖基化作用將葡萄糖合成為龍膽二糖和槐糖以誘導纖維素酶合成，所述β-葡萄糖苷酶通過水解木三糖成為木二糖以誘導半纖維素酶合成。

附圖說明

圖1為本發明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E的同源樹。

圖2為本發明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E提高里氏木霉和檜狀青霉的胞外纖維素酶糖化水解效率的比較圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。