[發明專利]使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法

有效

• 申請號: 201310685086.1
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN103822816A
• 公開（公告）日: 2014-05-28
• 發明（設計）人: 蘇杰;李喜和;趙高平;胡樹香;孫偉
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星繁育生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種使用熒光染料FITC與MITO鑒定混合精子的方法，其特征在于：它包括以下步驟：

一、配制試劑：

（1）配置FITC濃儲液：

?將FITC粉末中加入DMSO，使其終濃度為0.5M，分裝后避光在-20℃保存，使用期限為1年；

（2）配置MITO濃儲液：

?將MITO粉末中加入DMSO,使其終濃度為0.069mM/L，分裝后避光在-20℃保存，使用期限為1年；

?????（3）配置staining?talp精子染色緩沖液：

????????????????HEPES???????????????????40mM/L

??????????????????氯化鎂???????????????????0.4mM/L?

??????????????????氯化鈉???????????????????95mM/L??

??????????????????氯化鉀???????????????????3mM/L

??????????????????磷酸氫二鈉???????????????0.3mM/L

??????????????????碳酸氫鈉?????????????????10mM/L

??????????????????丙酮酸鈉?????????????????2mM/L?

???????????????葡萄糖???????????????????5mM/L

??????????????????乳酸鈉??????????????????25mM/L

??????????????????牛血清白蛋白????????????3g/L???????????

??????????????????超純水??????????????????其余為超純水；

?????二、精子染色：

（1）精子FITC染色：

?????①取500萬精子加入5ml的staining?talp精子染色緩沖液，使精子終濃度為100萬/ml；

?????②在步驟①的精子溶液中加入0.75μl的FITC濃儲液，使其終濃度為0.077mM/L，輕輕搖動將染色液搖勻；

?????③在37℃避光染色40分，將染色的精子輕輕搖晃；

?????④染色結束后，1500rpm離心10分，棄上清，再加入5ml?staining?talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；

?⑤1500rpm離心10分，棄上清，再加入5ml?staining?talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；

?????⑥1500rpm離心10分，棄上清，加入250μl?staining?talp精子染色緩沖液；

（2）精子MITO染色：

①取500萬精子加入5ml的staining?talp精子染色緩沖液，使精子終濃度為100萬/ml；

②在步驟①的精子溶液中加入1.81μl的MITO濃儲液，使其終濃度為3.45×10^-5mM/L，輕輕搖動將液體搖勻；

③在37℃避光染色10分；

④染色結束后，1500rpm離心10分，棄上清，再加入5ml?staining?talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；

⑤1500rpm離心10分，棄上清，再加入5ml?staining?talp精子染色緩沖液，輕輕搖動；

⑥1500rpm離心10分，棄上清，加入250μl?staining?talp精子染色緩沖液；

（3）精子混合：

將步驟（1）用FITC染色后的精子與步驟（2）用MITO染色后的精子等量混合，放在37℃，3h；

（4）檢測：

①對步驟（1）用FITC染色后的精子、步驟（2）用MITO染色后的精子進行熒光檢測；

②對步驟（3）FITC染色后的精子與MITO染色后的精子等量混合后3h?的混合精子進行熒光檢測?。