[發明專利]一株利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌

有效

• 申請號: 201310684008.X
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103695343A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳堅;方芳;廖淡宜;堵國成;吳惠玲;周朝暉;李鐵橋;黃早成
• 申請（專利權）人: 江南大學;廣東珠江橋生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一株利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，屬于微生物領域。?

背景技術

氨基甲酸乙酯（Ethyl?carbamate,EC）是一種致癌物質，主要會引發肺癌、肝癌等嚴重性腫瘤疾病，并且對人體的免疫系統造成傷害。研究發現，不僅酒類中含有氨基甲酸乙酯，而且在大豆發酵制品如醬油中同樣不同程度的含有此類物質。?

釀造醬油中氨基甲酸乙酯的主要前體物質是瓜氨酸與乙醇。因此降低醬油中瓜氨酸的含量是我們降低醬油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。?

在醬油生產中，酵母產生乙醇，一大類厭氧或兼性厭氧的乳酸菌可以把精氨酸通過精氨酸脫亞氨基途徑（ADI途徑）轉化成瓜氨酸。ADI途徑主要由三個基因控制：arcA基因，arcB基因，arcC基因，具體反應如下面的反應式所示。?

醬醪中的主要微生物有乳酸足球菌，嗜鹽四聯球菌，魏斯氏菌，鏈球菌，葡萄球菌，乳酸菌。乳酸菌是醬油生產過程中的優勢菌株，也是香味物質產生菌，但也是瓜氨酸積累量很高的菌株。?

本發明目的在于提供一株能利用瓜氨酸或者是不積累瓜氨酸的乳酸菌，從而降低醬油中氨基甲酸乙酯的含量。?

發明內容

本發明提供了一株嗜鹽四聯球菌，是在高鹽環境下能夠利用精氨酸且不積累瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌BBER23（Tetragenococcushalophilus）BBER23，該菌已于2013年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCCNO:M2013480。?

所述嗜鹽四聯球菌分離自日式工藝的醬醪，其保藏條件如下：從生長良好的平板上挑取單菌落轉接入含100g/l?Nacl的MRS培養基中，在30℃靜置培養四天，取500μL培養液移入含有500μL30%甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。?

嗜鹽四聯球菌分離培養基為改良MRS：100g/l?NaCl,溴甲酚紫0.06g/l，50u/ml制霉菌素，100g/l生醬油；30℃培養5-7天。?

氨基酸檢測培養基：酵母膏5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，NaCl180g/l，葡萄糖0.5g/l，Tween-801g/l，MgSO₄·7H₂O0.2g/l，MnSO₄·H₂O0.05g/l，FeSO₄0.4g/l，檸檬酸三胺2g/l，CaCO₃0.1g/l，吡哆醛-5-磷酸0.05g/l，K₂HPO₄2g/l，pH6.0。根據檢測需要添加相應氨基酸。?

將保藏的所述嗜鹽四聯球菌在含100g/l?NaCl的MRS固體培養基上劃線，于30℃靜置培養4天，挑取單菌落接入含100g/l?NaCl的MRS液體培養基，30℃靜置培養四天，離心10min（6000rpm，4℃）后去上清獲得菌體，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0）懸浮菌體。向5mL離心管中加入4mL含5g/l的精氨酸的氨基酸檢測培養基，接種400μL的懸浮菌液，接種后OD₆₀₀為7.8；30℃靜置培養5天，精氨酸含量降到0，瓜氨酸積累量為0，鳥氨酸大量積累。?

向5mL離心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸的氨基酸檢測培養基，接種400μL的懸浮菌液，接種后OD₆₀₀為7.8；30℃靜置培養5天后，瓜氨酸大量降低，鳥氨酸大量積累。?

向5mL離心管中加入4mL含3g/l的瓜氨酸及5g/l的精氨酸的氨基酸檢測培養基，接種400μL懸浮菌液，接種后的OD₆₀₀為7.8。30℃靜置培養5天后用HPLC的方法檢測培養基中精氨酸，瓜氨酸和鳥氨酸含量，觀測到精氨酸瓜氨酸含量降低，鳥氨酸大量積累，但精氨酸利用量大于瓜氨酸利用量。因此，在高鹽條件下這所述嗜鹽四聯球菌利用精氨酸并不積累瓜氨酸。?

本發明提供了一株能利用環境中的精氨酸和瓜氨酸的嗜鹽四聯球菌，耐鹽，能消耗掉氨基甲酸乙酯的前體物，從而降低環境中的氨基甲酸乙酯的含量，在降低發酵食品瓜氨酸、氨基甲酸乙酯含量方面有潛在應用價值。?

生物材料保藏?