[發明專利]檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201310683802.2
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103645326A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 吳凡;焦守恕
• 申請（專利權）人: 同昕生物技術（北京）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

技術領域

本發明涉及化學發光酶聯免疫技術檢測領域，尤其涉及檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其制備方法。

背景技術

脂蛋白相關磷脂酶A2（Lp-PLA2）是磷酸脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸脂酶，最初發現其可以降解血小板活化因子，曾被稱為血小板活化因子乙酰水解酶。l995年首次被克隆，其編碼基因(PLA2G7)，有12個外顯子，染色體定位于6p21.2212，由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質量為50×10³(50kDa)。Lp-PLA2以生物膜磷脂為天然底物優先作用于氧化磷脂sn22位上短脂酰鏈中的酯鍵，使水溶性強的磷脂產生游離脂肪酸和溶血磷脂參與磷脂的代謝。

循環中Lp-PLA2主要來源于血細胞，如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞和肥大細胞受炎癥刺激時少量分泌，并受炎性介質的調節，如γ2干擾素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子促進其分泌。聯合應用原位雜交和免疫組織化學技術研究發現，兔和人動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞可表達更高水平的Lp-PLA2mRNA和蛋白。人血漿中的Lp-PLA2與脂蛋白顆粒結合的形式存在，其中2/3與低密度脂蛋白(1ow?density?lipop?rotein,LDL)結合，主要是小而密的LDL結合，其中帶負電荷的LDL中的Lp-PLA2含量和活性更高，促進內皮細胞趨化因子釋放，促進炎癥反應。1/3與高密度脂蛋白(high?density?lipop?rotein,HDL)和極低密度脂蛋白(very?low?density?lipop?rotein,VLDL)結合。Lp-PLA2與人類HDL結合少的原因，可能是由于人Lp-PLA2氨基端的高度糖基化阻礙了其與HDL的結合。

目前實驗研究及流行病學研究結果揭示了Lp-PLA2生成多種促炎產物，參與從動脈粥樣斑塊形成到斑塊不穩定的各個階段，具有促進炎癥反應作用，可能成為新的心腦事件獨立預測因子。血漿Lp-PLA2測量是一個有價值的方法，可用來鑒別或預測具有心腦血管疾病高風險事件的個體。

目前為止，沒有見到利用Lp-PLA2與心腦血管疾病之間的相關關系來制備檢測人Lp-PLA2的水平的試劑盒的報道。

發明內容

本發明根據上述領域存在的空白和需求，提供了檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒及其制備方法。

本發明的一個目的是提供檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒。

本發明所提供的檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒，包括包被有抗脂蛋白相關磷脂酶A2單克隆抗體的化學發光板，還包括樣品處理液；所述樣品處理液主要由A液和B液組成；所述A液含有7.5g/L氯化銨、1.2g/L酪蛋白和1.2g/L硬脂酸鈉；所述B液含有0.5M?Tris-Hcl，PH7.6。

所述試劑盒還包括樣品稀釋液；所述樣品稀釋液由如下方法制備得到：將100ml山羊血清、20ml重量百分比濃度為1%的硫柳汞、10ml0.1M鐵氰化鉀、0.5ml吐溫-20、10ml10mg/ml的慶大霉素、以及余量為PH7.40.01M?PBS緩沖液定容至1000ml，即得到所述樣品稀釋液。

所述試劑盒還包括濃縮洗滌液；所述濃縮洗滌液由如下方法制備得到：將2.96gNaH₂PO₄·2H₂O、29g?Na₂HPO₄·12H₂O、234g?NaCl和20ml吐溫-20，加雙蒸水定容至1000ml，即得到濃縮洗滌液。

所述試劑盒還包括化學發光底物液；所述化學發光底物液由化學發光底物液R1和化學發光底物液R2組成；所述化學發光底物液R1為3.0mmol/L魯米諾與0.3mmol/L對碘苯酚的混合液；化學發光底物液R2為7.5mmol/L的雙氧水。

所述試劑盒還包括標準品溶液；所述標準品溶液為6個濃度梯度的脂蛋白相關磷脂酶A2抗原，所述濃度依次為：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。

所述試劑盒還包括高值對照液和低值對照液；所述高值對照液或低值對照液由向胎牛血清中添加重組脂蛋白相關磷脂酶A2制備得到；所述高值對照的終濃度為700ng/ml；所述低值對照的終濃度為300ng/ml。

本發明的另一個目的是提供所述檢測脂蛋白相關磷脂酶A2的化學發光酶聯免疫試劑盒的制備方法。