[發明專利]一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法

無效

• 申請號: 201310681572.6
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103694309A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 方弟安;張敏瑩;徐東坡;劉凱;周彥鋒;段金榮
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;G01N27/62
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;曹翠珍

技術領域

本發明屬于動物精子檢測領域，特別涉及一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法。

背景技術

動物的精子是一類結構和功能都十分特化的細胞，精子膜表面存在多種膜蛋白和蛋白受體復合物等，它們與精子發生、成熟獲能、精卵識別、受精過程等生殖生物學活動有重要功能。

精子膜表面蛋白是精子發生、成熟和精卵相互作用的重要分子，對其深入研究有助于揭示精子發生、成熟獲能和受精的生物學機制。成熟精子的質膜表面含有多種蛋白，它們自身固有或是外界粘附到精子表面，在維持精子形態結構完整等過程中發揮著重要的作用，特別是與精卵識別結合以及質膜融合等過程密切相關。因此精子膜蛋白組分的測定對于探索魚類精子獲能，精卵識別和生殖過程的生物學機制是非常重要的。

精子膜蛋白抽提方法通常是使用去污劑、超聲破碎、蔗糖密度梯度離心、生物素化等方法進行。抽提得到的精子膜蛋白往往需要透析濃縮(李彥臻等，2008)，精子懸液懸浮處理(潘洪強,2001)和利用鏈親和素對膜蛋白進行分離富集和洗脫等(Shetty?et?al.,2001)等步驟。這些步驟的會導致所提取精子膜蛋白的量和純度。目前，對人類和其他一些哺乳動物的精子膜蛋白研究報道較多，一些水生生物如海膽(Echinoidea)和鮑(Haliotis)是目前研究較多的實驗材料。但有關魚類精子膜蛋白的研究均未見報道。

發明內容

本發明的目的在于為了克服以上現有技術的不足而提供一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法。

本發明是由以下技術手段實現的：

一種提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，按照以下步驟進行：

（1）對所采集的魚類精巢或成熟精子樣本使用PBS與質量濃度為0.7%NaCl的漂洗緩沖液進行漂洗，除去碎屑物質，得到樣品液；

（2）緩沖漂洗后，采用懸浮緩沖液對樣品進行懸浮處理0.5-1h；加懸浮緩沖液再進行懸浮處理1-2h；取懸浮上清液加精子膜蛋白分離液，混勻，置搖床上，冰浴緩慢振搖1.5h，然后4℃離心，上清為精子膜蛋白溶液，沉淀為脫膜精子；

（3）將得到的精子膜蛋白溶液轉移至試管中，在25℃下孵育15-20分鐘，對混合物進行離心，獲得懸液的相分層，上層為水相層，下層為膜蛋白混合物層；留下層液體用于后續的膜蛋白純化；使用冰浴的TBS將所得膜蛋白粗提物，重復精子膜蛋白的分離步驟，得到較好濃度和純度的精子膜蛋白，取少量溶液測其蛋白含量，其余-20℃保存備用；

（4）對所抽提的精子膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，使用5×SDS-PAGE樣品溶解液對樣品進行處理；

（5）對所抽提的精子膜蛋白進行納米級串聯質譜Nano-LC?MS/MS技術檢測。

所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟（1）中使用PBS的濃度可以為0.01M。

所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟（2）中4℃離心條件可以為12000r/min，10min。

所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟（3）中離心條件可以為5000g，20-25分鐘。

所述的提取和檢測魚類精子膜蛋白的方法，步驟（3）中重復精子膜蛋白的分離步驟可以為2-4次

基于對長江刀鱭等江海洄游性魚類的精子膜蛋白提取和檢測的反復驗證，本發明提供的方法可以高效快速提取魚類精子膜蛋白，可以平均從5×10⁷個精子中可得到0.6mg膜蛋白，0.8mg胞質蛋白，整個提取過程可在2小時內完成。該方法與傳統的精子膜蛋白的提取方法相比，具有耗時少，效率高，在其他動物物種的精子膜蛋白研究中都可以推廣應用。通過該方法所提取的精子膜蛋白純度和蓋度高，可以用于精子發生和受精生物學的機制研究，研究結果可以為魚類的增養殖尤其是江海洄游性魚類的生殖繁育提供指導。

本專利方法采用去垢劑法和精子懸液處理的方法提取魚類精子膜蛋白，具有耗時短，所提精子膜蛋白產量和純度高的優點。

附圖說明

圖1是提取長江刀鱭精子膜蛋白的SDS-PAGE檢測和WB鑒定圖。

具體實施方式

實施例1

本實施例以長江刀鱭魚作為試驗對象，進行其精子蛋白的提取和檢測。

本實施例中所用的試劑以及配制方法如下：

(1)A液：0.25M蔗糖，0.1M?Tris-HCl，0.5M苯甲酰胺，1mM?EDTA，等體積混合得到A液；

B液：質量比為5%果糖，0.01M枸櫞酸鈉，等體積混合得到B液；