[發明專利]一種電轉染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法

在審

• 申請號: 201310680758.X
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103695311A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 楊慈清;王聰睿;李小英;林俊堂;范文艷;李瓊;劉彥禮;付蘇雷;賈陽陽;李晗
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12M1/42
• 分類號: C12M1/42;C12N15/85
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術領域

本發明涉及一種電轉染裝置，同時還涉及使用該電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法。

背景技術

神經元的遷移對于神經系統的形成以及發揮正常功能起著重要的作用，許多疾病就與神經元的遷移障礙有關。由于禽類視頂蓋的分層結構比哺乳類動物大腦皮質層的結構更復雜，因此研究其細胞的遷移機制相對更為困難。目前，神經元的遷移機制以及大腦皮層發生機制尚不明確，與神經發生相關的分子功能以及信號調節通路還有待進一步研究。

對神經元遷移發生紊亂相關分子機制的研究，必須借助活體動物模型，而神經系統是形成較早的一個龐大系統，研究早期影響中樞神經系統發育相關分子需要在胚胎發育過程中進行干預，由此進一步分析其作用。基因打靶技術是目前活體內基因沉默和超表達成熟的技術，而在發育生物學研究領域廣泛使用的模式動物雞胚中無法進行基因打靶，近年來建立的活體電轉基因技術實現了雞胚發育過程基因的抑制表達和超表達。

從最早1998年Ochiai?H等首次在雞胚中實現轉基因成功的報道以來，建立在雞胚活體電轉模型上開展了一系列研究。從目前研究進展來看，實現早期脊髓內轉染成功率和胚胎的成活都是比較高的，而且開展的研究也是較多，是因為雞胚脊髓中的轉染最佳時間在E2.5-E3，此時胚胎較小，采用開窗培養的方法能夠方便的進行轉染，由于脊髓轉染電極大多采用針狀電極，體積較小，只需要蛋殼側面打開較小的窗口就可以進行電擊。但是目前，針對雞胚神經元遷移研究最佳部位視頂蓋的研究并不多，主要原因在于在胚胎發育6天（E6）以后，胚胎將會下沉到蛋清中，此時無法進行轉染，從發育的時間上看最佳視頂蓋轉染的時間是在E5。但是由于在E5時胚胎較大，視頂蓋轉染無法采用針狀電極，多采用板狀電極，而板狀電極較大，蛋殼開窗由于窗口的限制，很難準確放置，轉染成功率低，而且直接利用現有電極不能夠實現轉染到視頂蓋正確的部位。

發明內容

本發明的目的是提供一種電轉染裝置。

本發明的目的還在于提供一種使用電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是提供一種電轉染裝置，包括用于與電源供應器測試端連接的第一電極和第二電極，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。

該裝置還包括電源供應器，所述電源供應器的測試端經兩個獨立的導線分別與第一電極和第二電極連接。

各導線與對應電極的連接部位設有手柄。

所述的第一電極為橢圓形的板形結構。

所述的第二電極由鉑金或黃金材料制成。

所述第二電極截面為直徑0.3-0.5mm的圓形。

本發明采用2個分別獨立的電極，放置位置和角度可以靈活調整；本發明的第二電極為針形電極，直徑較細，在放入雞胚視頂蓋底部時，不會對組織或卵黃膜造成損傷，避免由此引起的胚胎死亡，且能夠起到良好的導電作用，同時該針形電極呈弧形，弧形設計能夠在不損傷雞胚的情況下起到固定雞胚視頂蓋的作用；本發明的第一電極為板形電極，由于板形結構的面積較大，放置在視頂蓋上方（注入質粒一側）時，能夠增加質粒的轉染面積，提高轉染效率和成活率。

本發明各導線與對應電極的連接部位設有手柄，便于操作時手握。

本發明的第二電極由鉑金或黃金材料制成，具有良好的導電性能。

本發明所采用的技術方案還在于提供一種使用電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法，包括以下步驟：

1）雞胚培養

a）將新鮮受精雞蛋清洗、擦干，孵育，孵育第3天取出雞蛋，在雞蛋鈍端側面間隔1cm處分別打孔，從鈍端側面開孔處吸取蛋清；

b）然后密封開孔，繼續孵育至第5天，從雞蛋正上方開孔處開口，暴露胚胎，進行轉染；

2）雞胚轉染

在孵育第5天時，將質粒液注射到視頂蓋內，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈沖長度60ms，間隔100ms，電脈沖6次條件下轉染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。

所述孵育溫度為37.5-37.8℃，濕度為60%-65%。

所述取出蛋清的量為3-4ml。

所述注射質粒液的量為1-2μl；所述質粒液中質粒的濃度為2-4μg/μl。

步驟2）轉染過程中，第一電極放置于被轉染視頂蓋的正上方，即注射質粒位置的上方，無需插入卵黃膜內，只是接近視頂蓋浸入蛋清即可，而且不需要接觸視頂蓋。