[發明專利]一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法

在審

• 申請號: 201310679110.0
• 申請日: 2013-12-14
• 公開（公告）號: CN104711233A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發明（設計）人: 張濤
• 申請（專利權）人: 張濤
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，屬于食品深加工的領域。

技術背景

超氧化物歧化酶（Superoxide?Dismutase），簡稱SOD，是一種新型酶制劑，屬金屬酶.它是一種源于生命體的活性物質，SOD是機體內危害最大的氧自由基專一清除劑，亦是其他自由基最有效的清除劑，它與體內的谷胱甘肽過氧酶、過氧化氫酶聯手，把自由基轉化為水和氧分子。能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質。對人體不斷地補充?SOD具有抗衰老的特殊效果。?

從植物，特別是人們日常經常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能發生的交叉感染。利用全新的生物技術從植物中提取SOD，具有明顯的社會和經濟效益，市場前景廣闊。從植物中提取SOD的主要傳統工藝流程為:植物→打漿→超濾分離→有機溶劑去雜→柱層析精制→超濾濃縮→冷凍干燥→產品。

發明內容

本發明提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，該方法采用獨有的磷酸鉀緩沖液配方：50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有1mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有1mmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9；并且優化了離子交換柱和凝膠柱分離的條件；通過該法可以獲得純度更高、成本更低的SOD。

本發明的技術方案：

A、取新鮮的油菜葉1重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100-120目篩抽濾，將濾液以3000-5000轉/分鐘，離心16-25分鐘獲得葉綠體；

B、將A步驟所得葉綠體用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心20-30分鐘，獲得上清液即為粗酶液；

C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到50-60%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心30-40分鐘，取上清液；

D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93-97%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心40-50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD；

E、將D步驟所得的粗制SOD，加入3-5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過的溶液通過低溫真空濃縮至原體積的1/3-1/4；

F、將E步驟所得濃縮液經Sephadex?G-75凝膠柱或DEAE-?Sephadex?A-50離子交換柱進行提純；凝膠柱的洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進行梯度洗脫；

G、將F步驟所得洗脫液經低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體SOD。

其中，50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有1mmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有1mmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9。

本發明解決的技術問題：

1、采用了新的工藝流程，比傳統工藝步驟少，設備簡單，節約了成本，易于推廣。

2、采用了獨有的磷酸鉀緩沖液配方，在提高了分離效率的同時對SOD的活性進行了很好的保護，保證了成品的質量。

3、對不同類型的柱子采用新的洗脫條件，提高了產品的活性和純度，本發明可以將產品提純150倍，傳統工藝在100倍左右，而活性比傳統工藝提高了10倍。

具體實施方式

實施例1：

A、取新鮮的油菜葉100公斤，加入200公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100目篩抽濾，將濾液以3000轉/分鐘，離心25分鐘獲得葉綠體；

B、將A步驟所得葉綠體用20公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機4000轉/分鐘，離心30分鐘，獲得上清液即為粗酶液；

C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到50%，靜置2小時，經離心機4000轉/分鐘，離心40分鐘，取上清液；