[發明專利]一種酶聯免疫顯色底物液

有效

• 申請號: 201310676535.6
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103645181A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 譚柏清;王進;甘宜梧
• 申請（專利權）人: 山東博科生物產業有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N33/52
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

技術領域

本發明涉及一種穩定高效的酶聯免疫底物顯色液，屬于臨床體外檢測技術領域。

背景技術

1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，elisA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與辣根過氧化物酶（HRP）連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入辣根過氧化物酶（HRP）反應的底物液后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。該檢測體系中，底物顯色液作為最終決定了最后檢測的顯色程度，理想的顯色底物液應該具有穩定性高、保存時間長、顯色背景低、酶促顯色強度高的特點。

HRP?催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的過氧化物為?H₂O₂，其反應式如下：DH₂+?H₂O₂?????????????????????????????????????????????????????D+?H₂O，上式中，DH₂?為供氧體，H₂O₂?為受氫體。在?ELISA?中，DH₂?一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS?[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine?sulfonate-6)]。

OPD?氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在?492nm?處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是?HRP?結合物最常用的底物。OPD?本身難溶于水，OPD·2HCL?為水溶性。曾有報道?OPD?有致異變性，操作時應予注意。OPD?見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD?和?H₂O₂?一般分成二組分，OPD?可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的?ELISA?試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為?0.02%?H₂O₂?的應用液,只需加入?OPD?后即可作為底物應用液。

TMB?經?HRP?作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB?性質較穩定，可配成溶液試劑，只需與?H₂O₂?溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB?又有無致癌性等優點，因此在?ELISA?中應用日趨廣泛。酶反應用?HCL?或?H₂SO₄?終止后，TMB?產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為?405nm。

ABTS?雖不如?OPD?和?TMB?敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

各種供氫體的性質各不相同，市場上常見的供氫體選用的為TMB。但是TMB比較難溶于水中，而且在溶液狀態中性質不穩定，比較難以存放，這就造成了市場上常規TMB顯色液穩定性差，顯色不夠持久，經過長時間放置后顯色強度降低等問題。

發明內容

針對于以上常規TMB顯色底物液存在的問題，本發明提供一種穩定高效的TMB顯色液配方和配制方法，保證顯色底物液能在2～8℃條件下穩定放置2年，顯色效果可以持續1小時，滿足市場試劑盒。

本發明的TMB顯色底物液是由兩個試劑組分組成的，具體組分和濃度如下：

顯色液A: