[發明專利]一種粉葛同步酶處理發酵生產丁醇的方法

有效

• 申請號: 201310676487.0
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103667364A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 傅舒;劉曉風;鄭濤;李東;閆志英;袁月祥;孫永明
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12P7/16
• 分類號: C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 張帆;肖國華

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種酶處理粉葛原料發酵生產丁醇并提高丁醇產量的方法。

背景技術

隨著社會的發展，作為不可再生能源的石化能源日益枯竭，生物質能源等可再生能源得到越來越多的關注。生物質以農林資源、有機廢棄物等各種形式存在，可將其通過各種方式轉變為生物質能源。

丁醇作為生物質能源的一種，與燃料乙醇相比，它具有更高的燃值和疏水性，較低的揮發性，可與汽油以任意比例混合。丁醇的生產主要由丙酮丁醇梭菌進行丙酮丁醇發酵(Acetone-Butanol-Ethanol?fermentation，ABE)，其主要產物為丙酮、丁醇和乙醇，比例為3：6：1。為節約原料成本，秸稈等農業廢棄物生產燃料丁醇的研究得到了較大的關注。但是，作物秸稈等木質纖維資源分解困難，導致溶劑產量偏低。這時，能在邊際土地生長的非糧植物粉葛進入視野。

葛屬(Pueraria?DC)為豆科植物，在全世界有20個種，11個種位于中國。其中野葛(Pueraria?lobata(Willd)Ohwi)和甘葛藤(Pueraria?thomsonii?Benth.)的分布最廣，產量最高。據《中國藥典》記載，粉葛為甘葛藤的干燥根，當其中葛根素含量大于0.3%時方可入藥。作為多年生藤本植物的塊莖,利用粉葛生產丁醇具有以下優勢:1.粉葛原料中含有葛根素等高附加值的異黃酮物質，使其與木薯相比更具有經濟價值。這些異黃酮類物質，可以預防和治療高血壓、高血脂、冠心病、心絞痛、糖尿病等疾病。2.分布廣泛。在我國，除新疆、西藏、青海等少數地區未見有其生長。而且，在我國川渝、兩廣、兩湖、江西等地已有規模化種植。3.淀粉含量高，其淀粉含量占干重的60～70%，在生產燃料乙醇時，其土地畝產乙醇量比玉米和木薯均高。4.氮元素含量高于木薯，更利于微生物利用。因此，粉葛不但可以藥用，還是一種極具潛力的丁醇生產原料。開發粉葛原料作為丁醇生產的原料，能在改善能源生產消費結構，環境保護，社會經濟發展等方面有重要意義。

ABE發酵產物丁醇對生產菌株產生抑制。有研究表明，當丁醇濃度達11g/L時，菌體受到嚴重抑制。當丁醇濃度進一步到達15g/L時，菌體將不再生長。因此，許多研究者嘗試通過菌種改造提高發酵醪中的丁醇濃度。Chen等利用經過化學誘變而得到的拜氏梭菌BA101（Clostridium?beijerinckii?BA101）進行丁醇發酵，最終丁醇產量為20.9g/L，是目前報道的批次發酵中溶劑產量最高的菌株。但是，菌種改造始終面臨遺傳不穩定的缺點，難以進行工業化應用。本發明通過優化發酵工藝，利用酶處理同步發酵粉葛原料進行丁醇生產得到了較高的丁醇產量。

發明內容

本發明選用粉葛作為原料，利用酶的同步處理達到快速發酵生產丁醇并提高丁醇濃度的目的。

本發明提供一種同步酶處理發酵生產丁醇的方法，該方法包括如下步驟：

（1）將新鮮粉葛采收切塊后，直接粉碎得粉葛漿,或烘干粉碎得粉葛干粉；

（2）將步驟（1）得到的粉葛漿與水按基于干重的質量比1:9～1:6，或將步驟（1）得到的粉葛粉與水按質量比1:9～1:6混勻于95℃糊化30-60min，制成粉葛培養基；

（3）冷卻后向步驟（2）所述的粉葛培養基中添加1～5g/L的氮源；

（4）將步驟（3）所述的添加了氮源的培養基置于115℃滅菌20min；冷卻至50℃以下，在無菌條件下加入酶制劑，并接入培養基重量10%（v/m）的丙酮丁醇梭菌（Clostridium?acetobutylicum）種子液（即100g培養基添加10ml種子液），并于37℃同步預處理、發酵68-76h后得到丁醇發酵液。

其中，本發明上述方法中，步驟（3）中所述氮源選自醋酸銨、酵母膏、豆粕、麩皮和尿素，或其兩種或多種的組合；

步驟（4）中所述酶制劑為果膠酶、纖維素酶中一種或其組合。其中纖維素的標準酶活（CMC酶活）為1×10⁵u/g，酶活定義：1g酶粉于50℃，1min催化CMC水解生成1μg葡萄糖為一個纖維素酶CMC活力單位；果膠酶的標準酶活為5×10⁵U/g，酶活定義：1g酶粉于50℃，1min催化果膠水解生成1μg半乳糖醛酸的酶量為一個果膠酶活力單位；

所述酶制劑的添加量為1-5g/L粉葛發酵培養基。

所述丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）的保藏編號為CICC8008，購買于中國工業微生物菌種保藏中心。