[發明專利]含有綠色熒光蛋白基因的表達載體及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 201310673891.2
• 申請日: 2013-12-11
• 公開（公告）號: CN103667332A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 華權高;馬峰;易汪雪;沈鶴霄;余文祥;黃林;舒芹
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/64
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉杰

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種含有綠色熒光蛋白基因的表達載體及其構建方法與應用。

背景技術

綠色熒光蛋白，分子質量約為28kDa，由238個氨基酸構成，第65-67位氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成發光團，經共價鍵連接而成為羥苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激發產生熒光，是主要發光的位置。綠色熒光蛋白分子的形狀呈圓柱形，就像一個桶，發光的基團位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一個裝有色素的“油漆桶”。其發光團的形成不具有專一性，發出的熒光穩定，且不需要依賴其他基質而發光。

綠色熒光蛋白（GFP）在生物學領域中常被用作報導基因，是一種理想的示蹤標記，已經在生物技術、細胞生物學、轉基因動物、環境工程、微生物學等領域得到廣泛的應用。利用綠色熒光蛋白特有的發光機制，可將GFP作為蛋白標簽（protein?tagging），就是利用DNA重組技術，將目的基因與GFP構成融合基因，轉染或轉化至合適的細胞進行表達，而后借助熒光顯微鏡觀察細胞內活體中標記的蛋白質。因為GFP只有238個氨基酸，相對較小，所以將其與其他蛋白融合后不影響其自身的發光功能，利用GFP的這一特性，已經加深了對細胞內一些過程的了解，如發育和信號轉導、細胞分裂、染色體復制和分裂等。利用GFP來檢測目標蛋白的定位提供了一種對細胞內生理過程進行觀察的新方法。

鑒于綠色熒光蛋白可以作為報告基因，且在生物技術中被廣泛應用，但現有的帶有目的蛋白基因片段的表達載體在應用中需要經過挑取菌落和基因測序步驟來確定是否為正確的陽性克隆子，需要進行大量的盲目挑斑以及PCR鑒定的工作，費時費力。

發明內容

為了解決以上技術問題，本發明提供一種帶有綠色熒光蛋白的表達載體及該表達載體的制備方法。

本發明通過以下技術方案實現：

一種含有綠色熒光蛋白基因的表達載體，所述綠色熒光蛋白基因為sfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

一種含有綠色熒光蛋白基因的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

合成核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的sfGFP基因；

合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導下，以核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的sfGFP基因為模板進行PCR擴增，得到帶有酶切位點的核苷酸序列；

將空載質粒以及所述PCR擴增得到的帶有酶切位點的核苷酸序列分別進行雙酶切并回收酶切后片段，用DNA連接酶連接酶切后片段，并用于轉化大腸桿菌；

用含有與空載質粒中抗性基因相對應的抗生素的LB固體培養基進行篩選，挑取發綠色熒光的克隆子檢測載體序列，通過基因測序檢測正確的載體即為所述的含有綠色熒光蛋白基因的表達載體。

在上述技術方案中，所述空載質粒為pET-28a(+)或pGEX-6P-1。

在上述技術方案中，所述大腸桿菌為大腸桿菌RosettaBlue(DE3)。

以上所述含有綠色熒光蛋白基因的表達載體在陽性克隆子篩選上的應用，步驟如下：

合成目的基因；

合成帶有酶切位點的引物，并在此引物的引導下，以合成的目的基因序列為模板，進行PCR擴增得到帶有酶切位點的目的核苷酸序列；

將所述的表達載體和PCR擴增得到帶有酶切位點的目的基因序列分別進行雙酶切，回收酶切片段，用DNA連接酶連接酶切后的表達載體片段和目的基因片段，并轉化大腸桿菌，用含有與權利要求1中所述的表達載體具有的抗性基因相對應的抗生素的LB固體培養基進行篩選，挑取不發光的斑，即為帶有目的基因序列的克隆子。

本發明利用了Superfolder?GFP（sfGFP）能在各種條件下完成超折疊并發光的特性，其發光能力和發光強度優勢明顯強于普通GFP、EGFP等蛋白，為EGFP的1.6倍，肉眼即可觀察到明顯的綠色熒光，因此可以方便蛋白表達克隆過程中陽性克隆子的篩選，有利于快速、準確的對陽性克隆子進行篩選。

附圖說明

圖1為本發明實施例提供的pET-28a(+)-sfGFP表達載體結構示意圖。

圖2為本發明實施例提供的pGEX-6P-1-sfGFP表達載體結構示意圖。

圖3為本發明實施例提供的利用pET-28a(+)-sfGFP表達載體構建的pET-28a(+)-β2M載體結構示意圖。

圖4為本發明利用pGEX-6P-1-sfGFP表達載體構建pGEX-6P-1-β2M載體結構示意圖。

具體實施方式