[發明專利]一種陽離子型聚肽，以及基于所述聚肽的siRNA基因轉染試劑及其制備方法

無效

• 申請號: 201310672732.0
• 申請日: 2013-12-12
• 公開（公告）號: CN103694317A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 鄭濤;卜玉靜;陳璞;關建寧;蔣娟華
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12N15/87
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 韓朝暉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種陽離子型聚肽，以及基于所述聚肽的新型siRNA基因轉染試劑及其制備方法，具體的說，本發明提出了一種新型的多肽納米材料，該納米材料可用作轉染試劑。

背景技術

SiRNA轉染試劑在生物學領域應用非常廣泛，由于基因治療的關鍵是如何高效地將基因運送到目的細胞內，所以轉染試劑在生物學實驗中使用頻率極高。目前SiRNA轉染試劑主要包括病毒載體和非病毒載體，病毒載體的轉染效率遠高于非病毒載體，但其免疫毒性和致癌性成為臨床應用的最大難題。因此，高效的轉染試劑必須具備轉染效率高，低毒，生物相容性好的特點。現階段使用的轉染試劑都存在或多或少的缺點，所以需要開發出更加安全高效的轉染試劑。

較早使用的轉染方法有DEAE-葡聚糖法和磷酸鈣法。DEAE-葡聚糖法使用簡便，但是對細胞有一定毒副作用，而且一般只用于BSC-1，CV-1，COS細胞系，使用范圍較小。磷酸鈣法操作簡單，但是不適用于原代細胞，重復性差，有些細胞不適用且毒副作用較大，所以這兩種方法逐漸被淘汰。

目前應用最多的是陽離子脂質體法，帶電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，然后脂質體上剩余的電荷與細胞膜上的唾液酸殘基的負電荷結合，或者通過細胞的內吞作用進入細胞。這種轉染試劑使用方法簡單，通用于各類RNA，能轉染各類型的細胞，沒有免疫原性，雖在體內轉染中有很高的效率，但脂質體轉染試劑在體內能被血清清除，并在肺組織內積累，誘發強烈的抗炎反應，導致高水平的細胞毒性，很大程度上限制了此轉染試劑的應用。

陽離子聚合物是一種新興的轉染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞，這種轉染試劑除了具有陽離子脂質體的轉染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，還具有在體內轉染效率高，細胞毒性低等特點，所以發展潛力很大。

陽離子型聚肽是陽離子聚合物的一種，與聚乙烯亞胺和聚酰胺樹枝狀高分子相比同樣具有了良好的轉染效果，與siRNA的結合力很強，而且在體內可分解為氨基酸，不僅滿足了轉染需求，同樣可作為體內營養物質使用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有轉染試劑的不足，提供一種陽離子型聚肽，以及基于該聚肽的陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑，所述的轉染試劑是一種轉染效率高，毒副作用小，且在體內轉化成營養物質的新型轉染試劑。

本發明的另一目的還在于提供該轉染試劑的制備方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

一種陽離子型聚肽，其特征在于，所述的聚肽為精氨酸、色氨酸和亮氨酸組成的十八肽，其序列為RLWRLLWRLWRRLWRLLR。

本發明的陽離子型聚肽其分子式下式所示，分子量為2648道爾頓。

上述陽離子型聚肽，本領域技術人員可采用現有技術中普通多肽合成法合成。一種方法是通過多肽微波合成法，合成含有精氨酸、色氨酸和亮氨酸三種氨基酸的十八肽。例如，在本發明具體實施例中，所使用的十八肽即采用微波合成法自制，樹脂選用氯樹脂，反應溶劑為N,N-二甲基甲酰胺，脫保護選用20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，切割試劑為（87.5mlTFA+2.5mlEDT+5ml水+5ml茴香硫醚+5g苯酚)，合成產物經液相提純后凍干。合成中所使用試劑均為市場購得。

本發明還涉及一種陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑，其特征在于，所述的轉染試劑為序列為RLWRLLWRLWRRLWRLLR的陽離子型聚肽溶于無核酶水中的水溶液，其中聚肽自組裝成小于200nm的聚肽納米材料。

所述的陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑，陽離子聚肽的濃度優選為0.8mg/ml?~1mg/ml。

所述的陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑，其臨界膠束濃度范圍在0.8mg/ml?~1mg/ml。

所述的陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑，其包裹力的摩爾比范圍為28:1?~22:1。

所述的陽離子型聚肽siRNA基因轉染試劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟1）合成序列為RLWRLLWRLWRRLWRLLR的十八肽；

步驟2）將合成的十八肽溶解在無核酶水中，配成濃度為0.8mg/ml?~1mg/ml的溶液；

步驟3）將步驟2所得溶液用超聲波清洗儀超聲10至15分鐘后，用0.22μm的濾膜過濾，4℃保存備用。