[發明專利]一種在心血管植入材料表面改善多種仿生功能的方法

有效

• 申請號: 201310671971.4
• 申請日: 2013-12-07
• 公開（公告）號: CN103656750A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 楊蘋;李敬安;張琨;黃楠;王進;涂秋芬;趙安莎;向利潔;吳玨玨
• 申請（專利權）人: 西南交通大學
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/20;A61L27/18;A61L27/06;A61L27/04;A61L31/00;A61L31/04;A61L31/06;A61L31/02
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 張澎

技術領域

本發明屬于生物材料表面工程與仿生物制造工程交叉領域。

背景技術

心血管植入材料表面修飾技術發展至今，已逐漸趨于成熟，并廣泛應用于臨床。但目前臨床上所用材料表面療效，遠未達到預期目標。這主要是由于再好的表面修飾，其仿生功能也無法媲美機體本身心血管內血液接觸界面的生物學功能健全。

通過對材料表面的仿生，賦予材料良好的血液相容性、仿生再內皮化能力、抑制平滑肌細胞增殖能力和抑制巨噬細胞粘附能力是仿生生物化新技術的基礎。

內皮細胞外基質，是由內皮細胞分泌的由多種生物大分子和生長因子組成，在維持血管內膜和中膜的生理結構和功能中發揮重要功能。最近有研究發現完整的內皮細胞外基質與單一的內皮細胞外基質成分比較，更有助于植入材料表面內皮化和抗凝血。盡管如此，完整的內皮細胞外基質修飾的表面在異體植入過程中的免疫排斥和炎癥反應仍然是未來研究中亟需解決的問題。

透明質酸(HA)是細胞外基質的骨架和整合成分，其分子量從幾千到上百萬不等。不同分子量的HA對于細胞發揮不同的生物學功能。高分子量的HA對多種細胞的粘附起阻抗作用；同時由于其開放的空間鏈狀結構和自身忽視免疫排斥作用的功能，還具有保護蛋白質和生物因子免受免疫排斥作用影響的效果。高分子量的HA還具有較強的親水性，容易固定于親水性表面；同時由于其分子結構中含有大量羧基，也較容易以氫鍵、酰胺鍵或堿鍵的方式固定于羥基、氨基化或金屬表面。

材料表面圖形化是一種使細胞形態改變的技術，在條紋狀微圖形表面調控下，細胞可以在沒有流體剪切力的條件下達到形態拉長的目的，增強內皮細胞的一氧化氮(NO)和前列腺環素(PGI₂)等的分泌、細胞外基質構建，從而強化內皮細胞抗凝血、抑制平滑肌細胞增生、抑制巨噬細胞粘附等功能。

生物材料表面HA微圖形制備技術是一種比較成熟的現有技術，該技術可通過在材料表面制備不同尺寸的HA微圖形達到調控細胞形態、行為和功能的目的，但所制備的表面血液相容性不佳，其抗凝效果甚至不如原始材料表面；將內皮細胞外基質中的一兩種成分固定于生物材料表面，以達到兼顧抗凝血和促內皮雙重效果的目的，該方法也是一種成熟的現有技術，缺點在于所構造的表面僅著眼于一兩種功能的仿生，而不是血管內壁完整功能的仿生；通過體外材料表面脫內皮細胞技術獲得相對完整的內皮細胞外基質目前也已有報道，但就該表面的免疫排斥和抑制炎癥反應功能并未得到描述，此外該表面制備過程中內皮細胞的培養并未在仿生條件下進行，其形態、功能和所分泌的細胞外基質是否具備完整的功能也未得到全面論證。

綜上所述，通過制備高分子量HA條紋狀微圖形于心血管植入材料表面，調控血管內皮細胞形態和分泌功能，再融合脫細胞技術可制備一種材料表面仿生細胞外基質表面。這種仿生的細胞外基質表面應具備較好的原位血管內壁界面功能：可有效改善材料表面血液相容性，一定程度上促進血管內膜結構和功能修復，有效抑制平滑肌細胞的粘附和增殖，促進平滑肌細胞表型收縮，對巨噬細胞等免疫排斥和炎癥相關細胞的粘附和鋪展具有明顯的抑制作用。而目前尚無利用心血管材料表面條紋狀HA微圖形體外調控內皮細胞融合脫細胞技術獲得這種多功能仿生內皮細胞外基質的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種在心血管植入材料表面制備多功能仿生血管內皮細胞外基質的新方法，通過該方法對心血管植入材料表面進行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和細胞相容性。

本發明實現以上目的采用的技術方案是，一種在心血管植入材料表面制備多功能血管內皮細胞外基質的方法，其步驟為：

A、HA微圖形制備。在材料表面制備分子量為1×10⁵-1×10⁷DA的透明質酸(HA)條紋狀微圖形，HA和裸露材料條紋寬度分別為10-40μm和10-40μm，待用；

B、材料表面血管內皮細胞外基質的制備：將傳代2-5代的血管內皮細胞以1×10⁴-1×10⁵個/ml的密度種植于步驟A所述微圖形表面，在37℃，5%CO₂濃度的標準培養條件下培養1-3天，該步驟得到經HA微圖形調控后，形狀拉長、排布有序的血管內皮細胞；吸除用過的細胞培養液，培養細胞的樣品用37℃的PBS(PH=7.4)清洗1-5遍后，加入脫細胞液，37℃，5%CO₂濃度的標準培養條件下脫細胞處理10-50分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37℃的PBS(PH=7.4)再次清洗1-5遍，37℃干燥后即得目標物，步驟A和步驟B均在無菌條件下完成；