[發明專利]一種新型誘導肺瘤細胞凋亡的融合蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201310666392.0
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103739713A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 吳炯
• 申請（專利權）人: 吳炯
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及生物制藥和基因工程技術領域，尤其涉及含有人EGFR（L858R）突變蛋白序列結合蛋白和Apaf-1（1-97aa）、以及9R-tag的融合蛋白及其表達載體。

背景技術

肺癌是最常見且死亡率最高的一種肺部惡性腫瘤。在許多國家和地區肺癌的發病率占惡性腫瘤的首位。在過去的幾十年中，盡管肺癌的診療技術取得了較大發展，但是肺癌患者的生存率并沒有顯著提高。造成這一結果的主要原因，一方面是由于肺癌病理生物學特性復雜，重癥率高，大部分患者在初次確診時已進入晚期或已發生轉移；另一方面是由于缺乏有效的肺癌治療手段。

目前肺癌的主要治療手段仍然是手術、化療和放療，這些方法治療癌癥的特異性不足，副作用大，常常對正常組織和器官造成損傷。理想的肺癌治療方法應當能特異地清除癌組織，而不破壞正常組織，在給患者較小痛苦的前提下提升患者生存質量、提高生存率。以靶向治療、免疫治療等技術為代表的腫瘤治療新方法能夠滿足上述條件，且目前正在興起。其中，靶向治療，是指在細胞分子水平上，針對已經明確的致癌位點設計相應的治療藥物。該位點可以是腫瘤細胞內部的一個蛋白分子，也可以是一個基因片段。藥物進入體內后會特異地選擇致癌位點結合來發揮作用，使腫瘤細胞特異性死亡而不波及腫瘤周圍的正常組織細胞。

肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（NSCLC）兩大類，后者占肺癌總數的80%以上。許多NSCLC的發生被認為與表皮生長因子受體（EGFR）的激活突變有關。EGFR激活突變陽性的NSCLC在西方國家肺癌患者中的發病率通常為10%，而在亞洲肺癌患者中則高達30-40%。EGFR是一分子量為170kD的跨膜糖蛋白，含EGFR激活突變的腫瘤細胞增長迅速，容易發生轉移，復發率高，因此被認為是NSCLC靶向治療的一個比較理想的分子靶點。

現階段，全球約有50多種腫瘤靶向治療制劑在進行臨床試驗。在已批準進入臨床試驗的靶向制劑中，以腫瘤血管生成和EGFR為靶點的靶向藥物約占所有靶向制劑的60%左右。以厄洛替尼（erlotinib）和吉非替尼（gefitinib）為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR?TKI）是目前肺癌個體治療中常用的分子靶向藥物。但是此類靶向藥物在臨床實踐中的效果并不理想，即使對于短期療效顯著的患者，也會在6～12月內發生不同程度的耐藥現象。腫瘤耐藥性的產生是現行靶向腫瘤治療中遇到的主要障礙和失敗原因。并且，大量臨床實驗證據表明，腫瘤在產生抗藥性的過程中借助其腫瘤細胞的異質性和可塑性，在用藥的過程中發生演化，產生更具侵襲性的腫瘤細胞，使后續治療更具復雜性。

上述常規的靶向藥物是通過阻斷特定信號通路來實現抑制腫瘤細胞生長的目的。這一設計思路本身存在巨大缺陷—腫瘤細胞在藥物壓力之下可產生二次突變或激活其他替代細胞信號通路，這樣就繞過了靶向藥物的作用而產生抗藥性。由于細胞內信號通路網絡的復雜性，通過阻斷某一條信號通路來實現抗腫瘤作用的藥物勢必要面對巨大的潛在藥物抗性風險。因此，我們必須思考新的腫瘤靶向治療方向。

發明內容

為了克服現有技術的不足,本發明提供了一種新型誘導肺瘤細胞凋亡的融合蛋白，解決了目前靶向藥物存在的潛在藥物抗性風險問題。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種新型誘導肺瘤細胞凋亡的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：

[1]能與人EGFR受體EGFR（L858R）突變位點特異性結合的蛋白片段I；

[2]人Apaf-1蛋白片段II；

[3]由9個精氨酸殘基串聯而成的9R-tag序列的蛋白片段III；

[4]連接所述蛋白片段I和蛋白片段II的3個甘氨酸殘基組成的連接序列。

所述蛋白片段I優選為能與人EGFR（L858R）突變位點特異性識別結合的人源化小鼠抗體重鏈或輕鏈可變區序列蛋白片段；

所述蛋白片段II為人Apaf-1蛋白第1至97位氨基酸殘基序列蛋白片段；

所述小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列及其編碼DNA序列分別為：

重鏈可變區氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示：

QVQLQQSGAGLVKPSQTLSLSCKASGFNFKDYTMHWVRQAPGQGLEWVGDIYPGSGGTRYAQRFKSRVTISVDTSKNTAYMEMNSLRAEDTAVYYCTRNGGPSFYTGFDYWGQGTTVTVSS（SEQ?ID?NO.1）

重鏈可變區的編碼DNA序列為：