[發(fā)明專利]一種雙酶法從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310666358.3
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103642851A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;曾妍;王春娟;殷欣;李劍芳
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C07C59/64;C07C51/47
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用生物酶從小麥麩皮中制備阿魏酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年麥麩、玉米芯、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品細(xì)胞壁物質(zhì)產(chǎn)量約為3000萬噸，多被丟棄或用作動(dòng)物飼料，綜合利用率低，且經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高。阿魏酸(ferulic?acid)的化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一，在麥麩、米糠、蔗渣等谷物中含量較高，它是一種天然的抗氧化劑，具有抑制血小板聚集，促進(jìn)血小板溶解，抗血栓的形成，抗氧化，抗腫瘤等生理作用，在醫(yī)藥及食品等行業(yè)受到重視。從小麥麩皮中提取制備阿魏酸既可以延長小麥產(chǎn)業(yè)鏈條，提高小麥的附加值，同時(shí)又可以得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸，其經(jīng)濟(jì)意義、社會(huì)意義巨大。

目前阿魏酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成和堿解法，但這兩種方法均存在一定的缺陷。化學(xué)合成法反應(yīng)步驟多、周期長；堿解法的原料谷維素在米糠中含量低，產(chǎn)量受限；此外，這兩種方法都具有污染性，因此酶法生產(chǎn)阿魏酸具有較大優(yōu)勢。阿魏酸酯酶作為羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類，可以水解植物細(xì)胞壁中多糖與阿魏酸連接的酯鍵，并釋放出游離的阿魏酸單體或二聚體。單一使用阿魏酸酯酶，酶與纖維素酯鍵不能充分反應(yīng)，導(dǎo)致水解率低。如果采用阿魏酸酯酶和多糖水解酶共同作用于細(xì)胞壁，同時(shí)打斷阿魏酸酯鍵和糖苷鍵，無疑將使低聚糖的水解產(chǎn)率得到提高，同時(shí)又可生產(chǎn)阿魏酸。然而，酶解液是一個(gè)復(fù)雜的體系，從中分離出阿魏酸仍比較困難。尋找合適的阿魏酸的純化工藝也是實(shí)現(xiàn)阿魏酸工業(yè)化生產(chǎn)所需要突破的一個(gè)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供一種從小麥麩皮中提取制備阿魏酸，并且環(huán)保安全，周期短，操作簡單的工藝，為阿魏酸的酶法生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

利用重組阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重組木聚糖酶(reAoXynllA)雙酶法水解小麥麩皮，得到阿魏酸粗提液，經(jīng)HPD-300大孔樹脂純化制備高純度的阿魏酸產(chǎn)品。

所涉及到的具有重組阿魏酸酯酶(reAorFaeA)和重組木聚糖酶(reAoXynllA)活性的工程菌株GS115/AorfaeA(專利申請?zhí)枺?01210562540.X)和GS115/AoxynllA(Ann?Microbiol，2013，63：1109-1120)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

所述的阿魏酸的分析測定方法：

高效液相(HPLC)分析阿魏酸的釋放量。具體操作為：準(zhǔn)確稱取5mg反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量乙醇溶解后定容至50mL，即得0.1mg/mL的反式阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用緩沖液將阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度，用高效液相色譜法(HPLC)測定峰面積。以阿魏酸含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品過膜(0.45μm)后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀，ZW&A-C18反相色譜柱，紫外檢測器，檢測波長320nm，柱溫為30℃，流動(dòng)相為甲醇和1％乙酸二步梯度洗脫(0-10min內(nèi)甲醇濃度由20％上升為50％，10-20min內(nèi)甲醇濃度由50％上升為80％)，流速為1mL/min，進(jìn)樣量為20μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算阿魏酸含量。

所述的雙酶法提取小麥麩皮中的阿魏酸：

(1)稱取50g小麥麩皮，向其中加入適量0.3％(w/v)的醋酸鉀溶液，于95℃浸泡30min后，用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，并在105℃烘干至恒重，粉碎，過60目篩備用。

(2)準(zhǔn)確稱取0.5g去淀粉麩皮于100mL錐形瓶中，加入8mL?reAorFaeA酶液(約16.88U)和0.5mL?reAorXynllA酶液(約72.5515U)，用0.1mmol/L、pH5.0的磷酸鹽緩沖液定容至30mL，于40℃酶解10h，煮沸5min滅酶活，離心收集上清液即為阿魏酸粗提液。粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1mL后真空干燥，得到阿魏酸粗提產(chǎn)品，HPLC法分析阿魏酸的含量。

所述的大孔樹脂純化阿魏酸粗提液：

(1)將阿魏酸粗提液濃縮至阿魏酸質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，濃縮液調(diào)pH至4.0，選用HPD-300型大孔樹脂，室溫下，樹脂裝填量為20mL。將處理好的阿魏酸粗提液100mL以1mL/min上柱動(dòng)態(tài)吸附后，靜置2h，水洗柱子至流出液為無色，用100mL50％乙醇以1mL/min的流速洗脫，定量收集。

(2)收集到的餾分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到1mL后真空干燥，得到阿魏酸產(chǎn)品，HPLC法分析阿魏酸的含量(圖1)。