[發明專利]檢測RUNX1基因第3外顯子突變位點的方法和引物有效

申請號：	201310665303.0	申請日：	2013-12-06
公開（公告）號：	CN103710437A	公開（公告）日：	2014-04-09
發明（設計）人：	李文靜;陳奕磊;周曉犢	申請（專利權）人：	沈陽艾迪康醫學檢驗所有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12N15/11
代理公司：	浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100	代理人：	黎雙華
地址：	110044 遼寧***	國省代碼：	遼寧;21
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摘要：
搜索關鍵詞：	檢測 runx1 基因外顯子突變方法引物
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【說明書】：

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及檢測RUNX1基因第3外顯子突變位點的引物和方法。

背景技術

急性髓性白血病(AML)是由于髓系造血干／祖細胞發生累積性獲得性基因改變,導致細胞增殖、分化和凋亡途徑發生改變的一種惡性疾病。

RUNX1又稱為AML1,是RUNX轉錄因子蛋白家族中的成員之一,是白血病染色體易位最常見的靶位點。RUNX1是十分重要的轉錄因子,可雙向（促進或抑制）調節造血相關因子，從而調節造血干細胞的分化、凋亡及自我更新。RUNX1點突變常可以發生在骨髓增生異常綜合征(MDS)、AML、慢性粒單核細胞白血病(CMML)中，在骨髓增殖性腫瘤(MPN)中較少見。有研究指出，RUNX1的突變率在AML中是32%，MDS中是23%，CMML中是37%。在兒童白血病細胞中，已發現多種非隨機染色體易位,其中RUNX1受累最多,約占兒童白血病病例30%以上，如t(12;21)(TEL-RUNX1)、t(8;21)(RUNX1-ETO/MTG8)、t(16;21)(RUNX1-MTG16)等。RUNX1突變預示患者預后不良。對患者進行RUNX1突變篩查可能有助于進行臨床危險分層和制定治療決策。

文獻報道中，人們雖然未發現RUNX1基因存在突變熱點，但是一般都會檢測到它的第1-8外顯子的突變情況。另有文獻報道第3、4、5、8外顯子出現突變的概率較高，本發明中主要是針對第3外顯子突變情況的檢測。

目前可用基因突變檢測的方法有限制性片段長度多態性（ssCp）、基因測序和熒光定量PCR等。ssCp技術相對簡單，但酶切位點易受基因變異影響，影響結果判斷，由于方法本身的技術限制，檢測靈敏度低。采用熒光定量PCR法檢測RUNX1基因第3外顯子突變，由于檢測的外顯子序列較長并且涉及多個突變位點，所以需要設計多對引物及探針，既設計3條突變型探針與RUNX1基因第3外顯子覆蓋的3個突變位點分別特異性結合，設計3條對應的野生型探針分別與3個位點未突變的DNA結合，既檢測一個DNA樣本需同時進行3管PCR反應，每管反應體系包括1對擴增引物，1條野生型探針，1條對應的突變型探針，對樣本DNA的用量較大,檢測成本也很高，給臨床應用帶來了不便。此外，現有技術僅僅是檢測突變發生概率較高的單位點突變，而沒有檢測第3外顯子的整體突變情況。

本發明采用Sanger測序法檢測RUNX1基因第3外顯子的突變，并且設計的引物可以擴展整個第3外顯子，覆蓋待檢測的所有突變位點，既檢測一個DNA樣本僅需要進行1管PCR反應，與熒光定量方法比較可以節省2/3的DNA樣本用量，并且很大程度的節省了檢測成本。

發明內容

本發明提供檢測RUNX1基因第3外顯子突變位點的引物，采用Sanger測序法，可用于快速檢測AML患者體內RUNX1基因第3外顯子突變位點的突變情況。

本發明的目的在于提供檢測RUNX1基因第3外顯子突變位點的引物，其特征在于，包括：擴增覆蓋RUNX1基因第3外顯子突變位點的正、反向引物；其堿基序列為：

RUNX1-exon3-F：CCTAACTCAATCGGCTTGTTGT

RUNX1-exon3-R：GGCCAGTACCTTGAAAGCGAT。

進一步地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為

RUNX1-exon3-S-F：CCTAACTCAATCGGCTTGTTGT

RUNX1-exon3-S-R：GGCCAGTACCTTGAAAGCGAT。

進一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：RUNX1-exon3-F:RUNX1-exon3-R=1:1。

進一步地，所述一對測序引物的使用濃度比為：RUNX1-exon3-S-F:RUNX1-exon3-S-R=1:1。

本發明的目的還在于提供一種檢測RUNX1基因第3外顯子突變位點的方法，其包括如下步驟：