[發明專利]基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法

有效

• 申請號: 201310665170.7
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103614483A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 丁世家;周欽;李劍波;程偉;顏玉蓉;朱丹;申波;雷品華;張偉;李佳迅;董芳
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/42
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明涉及一種沙門菌基因的檢測方法，尤其涉及一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，屬于生物檢測領域。

背景技術

沙門氏菌屬腸桿菌科,是革蘭陰性腸道桿菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙門氏菌感染后主要引起食物中毒、胃腸炎、傷寒和副傷寒。有研究表明，沙門氏菌的侵襲蛋白與其致病性密切相關，決定著細菌進入宿主上皮細胞的能力。它主要由一系列基因編碼，其中invA是編碼沙門菌侵染上皮細胞表面蛋白的基因，與該菌致病性密切相關，是沙門菌特有的。

目前，最常用的腸道致病菌檢測方法主要有三種：傳統的分離培養鑒定、酶聯免疫吸附法（ELISA）和聚合酶鏈式反應（PCR）。傳統的分離培養鑒定法是將細菌分離培養后通過菌落計數和菌落形態、染色特征、生化反應等方法對細菌進行鑒定，該方法是細菌鑒定的金標準方法，但是其耗時費力。ELISA方法是基于抗原抗體反應的免疫學檢測，與傳統的分離培養鑒定方法相比較，縮短了檢測時間，但是仍然需要細菌培養這一步，至少需要24～48小時才能得出準確的結果，而且該方法的檢測限一般為≥10⁵CFU?mL^-1，難以滿足低濃度細菌的檢測。PCR技術與上述兩種方法相比較，優點是較高的靈敏度，但是PCR結果容易出現假陽性；目前實驗室主要用凝膠電泳技術來檢測PCR擴增的片段，但是凝膠電泳技術的分辨率較低且需要較高精確度的熱循環儀，因此限制了PCR技術在實驗室檢測細菌的廣泛運用。另一方法，不使用熱循環儀的核酸依賴的擴增（NASBA）和自主序列復制系統（ASR）,在特異性上又大打折扣，主要是由于必須用一個相對較低的溫度40℃來進行擴增。鏈置換擴增術（SDA）利用四種引物在等溫條件下擴增,很大程度上克服了這些缺陷，但是仍然存在薄弱的環節：必須利用昂貴的修飾核苷酸作為底物來進行擴增反應。

生物學研究領域中經常遇到一些不能直接擴增的待測分子，且由于其濃度較低而無法檢測，因而信號放大技術對不能進行直接擴增的低濃度待測分子的檢測顯得尤為重要。核酸分子體外擴增是生物技術研究的重要手段，如用于病毒檢測和遺傳病點突變檢測方面的連接酶鏈式反應（LCR）、支鏈DNA信號放大系統（bDNA）和侵染探針技術（Invader）；用于快速準確檢測和定量分析RNA的NASBA和轉錄介導的擴增（TMA）；用于檢測目的DNA片段的Qβ復制等。目前為止，聚合酶鏈式反應（PCR）和滾環擴增（rolling?circle?amplification，RCA）仍是使用較多的擴增技術。RCA是新近發展起來的一種恒溫核酸擴增方法。以環狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物（與部分環狀模板互補），在酶催化下將dNTPs轉變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復模板片段。這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。RCA技術的優勢是：高靈敏度、高特異性、簡單、易操作、多元性、高通量。

納米顆粒是一種人工合成的微小顆粒，它的形態可能是乳膠體、聚合物、陶瓷顆粒、金屬顆粒和碳顆粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin，C.A.，et?al；)發現表面修飾有核酸探針的13nm金顆粒溶液中加入與修飾核酸互補配對的目標核酸分子時，由于金顆粒聚集導致溶液的顏色由紅變藍。自此利用納米顆粒來進行生物分子檢測的研究得到廣泛應用。目前通用的方法主要分為兩種，一種是利用在金或銀納米顆粒修飾核酸探針，根據溶液的顏色變化來檢測目標核酸分子，優點是檢測方法簡單，但是所用的納米顆粒成本較高；另一種是利用在顆粒表面修飾核酸分子，通過不同的核酸擴增手段后加入熒光探針來進行目標分子檢測，優點是檢測的靈敏度高，但是熒光探針的成本也較高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于構建快速和超靈敏檢測沙門菌invA基因的方法，選用沙門菌高度保守的invA基因，設計與其特異性結合的探針，利用滾環擴增與金納米技術，用電化學策略檢測沙門菌，提供一種檢測設備小型化、簡便快速、靈敏度高、檢測成本低的檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種基于滾環擴增和金納米對沙門菌invA基因檢測的方法，包括以下步驟：

1）將裸金電極拋光,洗滌，然后浸入食人魚溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；

2）將巰基標記的捕獲探針滴加于上述金電極上，置于4℃冰箱中過夜；