[發(fā)明專利]金黃色葡萄球菌MntC重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310665113.9
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103694323B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾浩;鄒全明;樊紹文;盧陸;楊茜;敬海明
• 申請（專利權(quán)）人: 成都?xì)W林生物科技股份有限公司;中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C12N15/31;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/18;A61K39/085;A61P31/04;C07K16/12;G01N33/68;G01N33/569;C12R1/445
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標(biāo)代理有限公司11012
• 代理人: 黃澤雄,陳悅軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種金黃色葡萄球菌（SA）MntC重組蛋白。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus，SA)，以下簡稱金葡菌，有“嗜肉菌”的別稱。作為革蘭氏陽性菌的代表，它是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種重要致病菌。感染以急性、化膿性為特征，局部感染可引起皮膚和軟組織等的化膿性感染，經(jīng)久不愈；全身感染可導(dǎo)致骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴(yán)重感染及并發(fā)癥，死亡率高達(dá)20％。同時(shí)，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。因此，加強(qiáng)對金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗將對有效控制金葡菌耐藥性蔓延和臨床金葡菌廣泛感染具有重要的戰(zhàn)略及現(xiàn)實(shí)意義。

SA的生存需要多種金屬離子，它們參與多種生理過程，如新陳代謝、DNA合成和毒力因子的監(jiān)管等。這些離子的攝取與特定的蛋白有關(guān)，利用這些特定蛋白免疫動(dòng)物從而產(chǎn)生特異抗體不失為有效疫苗的一種選擇。鐵離子決定蛋白IsdB就被Merck公司做為候選疫苗進(jìn)行過臨床試驗(yàn)。錳離子也是SA生長所必需，它可以保護(hù)SA免受宿主嗜中性粒細(xì)胞殺傷，在SA的免疫逃避中發(fā)揮了重要作用。SA在感染早期通過上調(diào)錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白C（MntC）并獲得錳離子是逃避被殺傷的關(guān)鍵機(jī)制。然而，該元素?cái)z取過多會(huì)導(dǎo)致毒性，因此，錳的攝取是被高度調(diào)節(jié)的。錳離子代謝相關(guān)蛋白在SA感染時(shí)比IsdB更早表達(dá)，這些蛋白包含一個(gè)ATP合成蛋白MntA、一個(gè)完整的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntB和一個(gè)錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntC。其中MntC是一種高度保守的細(xì)胞表面蛋白。最近，MntC被確定在SA細(xì)胞膜表面表達(dá)，然后在多種體內(nèi)感染模型中出現(xiàn)。因而將MntC作為抗原免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對該蛋白的抗體，應(yīng)能在早期阻斷其調(diào)節(jié)錳代謝的功能從而起到抵御SA感染的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在提供一種重組的金黃色葡萄球菌錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MntC，將其用作抗原，制備用于檢測、預(yù)防或治療SA感染的生物制品。

在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種金黃色葡萄球菌的MntC重組蛋白，所述MntC重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供編碼本發(fā)明的MntC重組蛋白的核苷酸序列，以及包含所述核苷酸序列的載體和宿主。

在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供一種制備本發(fā)明的MntC重組蛋白的方法。

在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供一種發(fā)酵MntC宿主及制備MntC重組蛋白的方法。

在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供一種純化本發(fā)明的MntC重組蛋白的方法。

在本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供本發(fā)明的MntC重組蛋白作為抗原的應(yīng)用，以及所述MntC重組蛋白在制備用于檢測、預(yù)防或治療SA感染的生物制品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供由本發(fā)明的MntC重組蛋白免疫產(chǎn)生的多克隆抗體以及所述多克隆抗體在制備用于檢測、預(yù)防或治療SA感染的生物制品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第八個(gè)方面，提供包含本發(fā)明的MntC重組蛋白的組合物或試劑盒。

本發(fā)明采用基因工程技術(shù)重組表達(dá)所述融合蛋白，不僅表達(dá)量高、便于分離純化，而且免疫原性強(qiáng)、安全無毒性。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，本發(fā)明的MntC重組蛋白可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用，能夠用于制備檢測、預(yù)防或治療SA感染的生物制品。

附圖說明

圖1、MntC基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：目的基因片段MntC(855bp)。

圖2、表達(dá)載體pGEX-6p-2-MntC的酶切鑒定結(jié)果：M：核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4：重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-2-MntC1、2、3、4，其中3號、4號是重組成功的質(zhì)粒，酶切后分離的片段4800bp和855bp。

圖3、MntC親和層析結(jié)果：含GST標(biāo)簽的融合蛋白酶切結(jié)果：M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：酶切前，含有GST標(biāo)簽的融合蛋白；2：酶切后，在上清獲取的目的蛋白（密碼優(yōu)化工程菌）；3：酶切后，非特異性結(jié)合在凝膠珠上的目的蛋白和特異性結(jié)合在凝膠珠上的酶和GST標(biāo)簽（密碼優(yōu)化工程菌）；4：酶切后，在上清獲取的目的蛋白（密碼未優(yōu)化工程菌）；5：酶切后，非特異性結(jié)合在凝膠珠上的目的蛋白和特異性結(jié)合在凝膠珠上的酶和GST標(biāo)簽（密碼未優(yōu)化工程菌）。

圖4、MntC工程菌在四種培養(yǎng)基中的生長曲線。