[發(fā)明專利]一種二次親和層析法提取激肽釋放酶原的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310659583.4
• 申請(qǐng)日: 2013-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN103667224A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;林曉磊;劉振海;劉翠珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/64
• 分類號(hào): C12N9/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種應(yīng)用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法。

背景技術(shù)

激肽釋放酶原是激肽釋放酶的前體，激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它包括血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶兩種類型，均能使激肽原釋放出一種多肽——激肽，而激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein?kinin?system，KKS)是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一，作為一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能，與心臟病、腎病、炎癥反應(yīng)、癌癥等疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。

近年來在心血管系統(tǒng)方面的研究進(jìn)展很快，許多臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗死及左心室肥厚等疾病的發(fā)生與KKS的活性降低有關(guān)。因而深入研究KKS的作用為研究心血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療手段提供了又一新的途徑。

本發(fā)明人自2008年開始對(duì)胰酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，特別是在糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的生產(chǎn)過程中，不斷探索，力求優(yōu)化完善工藝參數(shù)，并且在原有工藝的基礎(chǔ)上另辟蹊徑，成功完成提取激肽釋放酶原的工藝研究，其收率為0.2％～0.4％，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了種應(yīng)用二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，特別是采用優(yōu)化原有親和層析工藝，得到激肽釋放酶原。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種二次親和層析提取激肽釋放酶原的方法，其特征在于：在通過對(duì)原有工藝的優(yōu)化，提取所得激肽釋放酶原收率為0.2％～0.4％。在發(fā)明技術(shù)方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟：

1)原料預(yù)處理

胰臟洗凈后，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。

2)蛋白浸漬提取

2.1)取預(yù)處理過的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿(必要時(shí)應(yīng)絞3次)，加入胰漿2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次攪拌，浸漬提取。

2.2)浸漬物過濾后，濾渣再用1倍量的冰冷硫酸重復(fù)上述過程，再進(jìn)行過濾，棄濾渣，合并2次濾液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到40％飽和度，冷室放置，過夜。

2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過濾，上清液和濾液合并，得提取液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到70％飽和度，冷室放置過夜。

3)分級(jí)沉淀

3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過濾至干，加入3倍于濾餅重的冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40％和70％飽和度分級(jí)沉淀；

3.2)將最后一次70％飽和度沉淀濾餅，加入1.5倍于濾餅重的冰水溶解，并加入0.5倍濾餅重量的飽和硫酸銨溶液。

4)一次親和層析

4.1)用適量的0.01-0.3mol/L，PH5-10的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；

4.2)將混合液流經(jīng)此柱，流速控制在1-5mL/min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；

4.3)平衡后，用0.1-5mol/L的NaCL溶液洗脫完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。

5)二次親和層析

5.1)用適量的0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸鹽緩沖液來平衡親和層析快膠柱；

5.2)平衡后，用含0.1-3mol/L?NaCl的0.01-0.3mol/L，PH3-8的醋酸鹽緩沖液洗脫完全，流速控制在1-5mL/min左右，得含激肽釋放酶原的洗脫峰。

6)結(jié)晶

6.1)將含激肽釋放酶原的洗脫峰于-20℃冰箱中靜置結(jié)晶22～24h；

6.2)將結(jié)晶減壓抽濾，干燥后得激肽釋放酶原。

經(jīng)核算，所得激肽釋放酶原收率約為0.2％～0.4％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

選用二次親和層析提取激肽釋放酶原，在穩(wěn)定收率的前提下，其理化性質(zhì)和生物活性也保持穩(wěn)定，從而有利于下一步對(duì)激肽釋放酶原進(jìn)行精制，最終使激肽釋放酶的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，特別是采用二次親和層析優(yōu)化原有工藝，激肽釋放酶原收率0.2％～0.4％，節(jié)約成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。

實(shí)施例1

1)原料預(yù)處理

胰臟洗凈后，去掉脂肪、結(jié)締組織等雜物，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。

2)蛋白浸漬提取