[發明專利]血清總膽汁酸檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201310659472.3
• 申請日: 2013-12-10
• 公開（公告）號: CN103616431A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 丁敏;羅娟;張曉清;朱明松;崔悅;左明
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種血清總膽汁酸檢測試劑盒，其特征在于：包括血清樣品預處理液、磷酸鹽緩沖液、3α-羥基類固醇脫氫酶(3α-HSD)、氧化型輔酶I(NAD⁺)及絲網印刷電極。

2.根據權利要求1所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒，其中，所述絲網印刷電極包括PET基板，PET基板上以碳漿印制工作電極和輔助電極、Ag／AgCl漿印制成參比電極，工作電極、輔助電極和參比電極與相應的電極觸點間通過碳漿連接，再在PET基板上除工作電極、輔助電極和參比電極形成的一圓形工作區域外印刷上一層絕緣膠。

3.根據權利要求1或2所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒，其中，所述血清樣品預處理液為甲醇。

4.根據權利要求1或2所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒，其中，所述3α-HSD活性為40U／mL，所述NAD⁺濃度為100mmol／L。

5.根據權利要求1或2所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒，其中，所述磷酸鹽緩沖液為0.2mol／L，pH=12.2的磷酸鹽緩沖液。

6.根據權利要求5所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒，其中，所述磷酸鹽緩沖液由0.2mol／L磷酸氫二鈉溶液和飽和氫氧化鈉溶液配制。

7.一種如權利要求1—6任意之一項所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)用所述血清樣品預處理液除去血清樣品中的蛋白；

2)將除去蛋白后的所述血清樣品離心，取上清液用氮氣吹干，用磷酸鹽緩沖液復溶；

3)分別取步驟2)得到的溶液、3α-HSD溶液及NAD⁺溶液于Ep管中并混勻，在室溫下進行酶反應10min，得到膽汁酸酶催化反應混合液；

4)所述絲網印刷電極與電化學工作站連接，取步驟3)得到的所述膽汁酸酶催化反應混合液滴加在所述電極的工作區域，用示差脈沖伏安法對酶反應產物NADH的氧化峰電流進行測定。

8.根據權利要求7所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)用甲醇除去血清樣品中的蛋白；

2)將除去蛋白后的所述血清樣品離心，取上清液用氮氣吹干，用0.2mol／L，pH=12.2的磷酸鹽緩沖液復溶，所述甲醇，血清樣品與磷酸鹽緩沖液的體積比為12∶4∶1；

3)分別取步驟2)得到的溶液、40U／mL的3α-HSD溶液及100mmol／L的NAD⁺溶液于Ep管中并混勻，在室溫下進行酶反應10min，得到膽汁酸酶催化反應混合液。所述步驟2)得到的溶液，3α-HSD溶液與NAD⁺溶液的體積比為10∶1∶10；

4)所述絲網印刷電極與電化學儀連接，取步驟3)得到的所述膽汁酸酶催化反應混合液滴加在所述電極的工作區域，用示差脈沖伏安法對酶反應產物NADH的氧化峰電流進行測定。

9.如權利要求8所述的血清總膽汁酸檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

1)取100μL血清樣品于Ep管中，渦旋條件下逐滴加入300μL甲醇除去血清中的蛋白；

2)將除去蛋白后的血清樣品離心，取上清液在60℃用氮氣吹干，用25μL0.2mol／L，pH=12.2的磷酸緩沖液復溶；

3)分別取10μL步驟2)得到的溶液、1μL40U／mL的3α-HSD溶液和10μL100mmol／L的NAD⁺溶液渦旋混勻，在室溫下進行酶反應10min，得到膽汁酸酶催化反應混合液；

4)所述絲網印刷電極與電化學儀連接，將步驟3)得到的膽汁酸酶催化反應混合液滴加在所述電極的工作區域，對酶反應產物NADH的氧化峰電流進行測定從而對血清總膽汁酸定量，其參數設置為：低電位0V，高電位+1V，電位增量0.005V、振幅0.1V、脈沖寬度0.05s、脈沖周期0.2s。