[發明專利]一種測定交聯透明質酸鈉凝膠中聚乙二醇殘留量的方法

有效

• 申請號: 201310657504.6
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103630536A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 趙永亮;王衛國;王化鵬;孟甜甜;丁金聚;彎家立;賈柯;張鵬;穆甲俊;陶宜辰
• 申請（專利權）人: 河南工業大學;趙永亮
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N1/28
• 代理公司: 鄭州科維專利代理有限公司 41102
• 代理人: 張欣棠

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技術領域

????本發明涉及生物化學、藥物化學與藥物分析技術領域，具體涉及一種測定交聯透明質酸鈉凝膠中聚乙二醇殘留量的方法。

背景技術

透明質酸是廣泛存在于生物體中的一種天然保濕因子，1g透明質酸至少持水600g，透明質酸是由雙糖單位D-葡萄糖醛酸與N-乙酰葡糖胺多次重復排列所組成的酸性大分子多糖，廣泛地應用于化妝品、食品和醫藥領域，商品一般用其鈉鹽，即透明質酸鈉（SH）。天然的透明質酸鈉凝膠具有良好的生物相容性好，然而因其易被降解，在體內存留時間短，限制其廣泛應用。通過化學修飾制備交聯凝膠是目前提高或延長其穩定性的主要手段。目前制備交聯凝膠常用的方法是以1,4-丁二醇二縮水甘油基醚（l?,?4?-butanediol?diglycidyl?ether?,?BDDE）、二乙烯基砜(Divinyl?sulphone，DVS)、碳二亞胺(Biscarbodimide，EDC)等為交聯劑采用一定的工藝技術制成，但是這些交聯劑都有一定的刺激性和毒性，交聯劑在凝膠制品中的殘留量或含量各個國家都有嚴格的規定。聚乙二醇是一種被世界各國批準的既可食用又可藥用的化合物，在醫藥領域，它不僅常作為口服制劑的輔料，還是一些注射劑常用的載體，無毒，具有良好的生物相容性且易被機體排出體外。用PEG做交聯劑制備交聯透明質酸鈉凝膠已引起人們的廣泛關注和高度重視，PEG交聯的透明質酸鈉凝膠具有明顯的優越性和廣闊的市場前景。

雖然PEG應用廣泛，但無論是在食品還是在藥品中，PEG對機體來說都是一種外來的化合物，所以在相關產品中其含量或殘留量都有嚴格的限制，必須進行檢測。目前國內外見于報道的分析檢測PEG含量或殘留量的方法主要有紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、高效液相色譜、分光光度法等，但這些方法大都是針對液態樣品如疫苗、尿液等液體中PEG的含量進行檢測的，對于凝膠中PEG殘留量的檢測尚未見報道。而且在已報道的上述方法中，紙色譜的分離時間較長，且同薄層色譜一樣，難以對PEG進行精確定量。氣相色譜和高效液相色譜是對PEG進行定量檢測的常用方法，然而氣相色譜所測定的PEG分子量較低，1000Da為最高上限，且分子量大于500的PEG需進行衍生化后再檢測，衍生步驟耗時且衍生物穩定性不高。高效液相色譜可對PEG進行分離和定量，大多數高效液相色譜方法使用的是示差折光檢測器，而這種方法由于靈敏度低應用范圍也不普遍，而且液相色譜儀器設備投資大，并且所需試劑耗材昂貴。分光光度法測定PEG含量主要有D試劑法和氯化鋇法。由于D試劑法配制試劑過程繁瑣且不穩定易降解，硝酸鉍價格昂貴，且該方法的最低檢測限偏高（大于2μg/mL）而使其應用越來越少。Childs于1975年首次建立了PEG的氯化鋇檢測法，其基本原理為PEG與鋇離子和碘離子形成復合物（1:1:1），在535nm處的光密度值與PEG的含量呈線性關系進行檢測，后經B.?Skoog和G.E.C.Sims及T.J.Snape改進，至今仍在應用。然而B.?Skoog報道的PEG的最低檢測限是5?μg/mL，G.E.C.Sims和T.J.Snape的研究結果中PEG的含量低于2?μg/mL時就檢測不到，而在醫學美容等領域相關交聯凝膠產品中的交聯劑的殘留量一般應小于2?μg/mL才算符合要求，目前還缺乏采用分光光度法檢測出凝膠中PEG600-20000殘留量小于2?μg/mL的相關技術和方法。

發明內容

本發明針對已有技術的不足，提供一種交聯透明質酸鈉凝膠中聚乙二醇殘留量的測定方法，通過提供一種凝膠樣品的前處理或預處理方法，再加上一種非常規標準曲線的制作，建立了一種可簡單、快速檢測交聯透明質酸鈉鈉凝膠中PEG殘留量（小于2?μg/mL）的痕量分析方法。該方法對凝膠樣品進行特殊的預處理，用95%或無水乙醇沉淀該凝膠，離心取上清液檢測其聚乙二醇殘留量。依據PEG與鋇離子和碘離子形成1:1:1的復合物的光密度與PEG的含量在535nm處呈線性關系的原理，檢測凝膠樣品中PEG的殘留量。該方法與其他方法相比，可以大大降低實驗成本且靈敏度高，穩定性好，簡單安全，方便快捷。

該測定交聯透明質酸鈉凝膠中聚乙二醇殘留量的方法包括以下工藝步驟：

????（1）樣品預處理

交聯透明質酸鈉凝膠的樣品預處理：將PEG交聯的透明質酸鈉凝膠用7-14倍體積的95%乙醇或無水乙醇醇沉多次，對所得沉淀干燥并粉碎，將部分粉碎后的顆粒或粉末在108-124℃下復溶10-30min，精密稱取復溶后的凝膠1.0g，加入2?mL無水乙醇，密封，經漩渦振蕩器振蕩，使凝膠沉淀，然后于5000-18000r/min離心3-30min，取上清液待測；