[發明專利]一種用高效液相色譜儀進行桿狀病毒定量的新方法

無效

• 申請號: 201310656264.8
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103743830A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 李俊輝;趙毅
• 申請（專利權）人: 新疆天康畜牧生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

本發明涉及對昆蟲桿狀病毒定量分析，采用的新方法縮短了桿狀病毒定量的時間，靈敏度，降低了實驗成本，提高實驗功效。

背景技術

常規的昆蟲桿狀病毒定量方法是使用細胞培養液將桿狀病毒定進行連續10倍梯度稀釋，稀釋后將病毒接種于96孔板中，然后將昆蟲細胞接種于96孔板中，將96孔板置于27℃恒溫培養箱中培養約7日，用間接免疫熒光進行病毒的毒價測定。此方法檢測周期為8～9天，毒價的判定受人員和設備的影響而造成差異，導致檢測結果的誤差。

文獻檢索披露的昆蟲桿狀病毒定量的SOP：用昆蟲細胞培養液將桿狀進行連續10倍梯度稀釋(10^-1～10^-11)，每個稀釋度取100μl加至96孔板中(每個稀釋倍數做八重復)，然后將昆蟲細胞密度調整至約為1×10⁵個細胞/ml，于96孔板中加入100μl/孔的細胞懸浮液，將96孔板置于27℃恒溫培養箱中培養約7日，用間接免疫熒光法進行病毒的毒價測定，培養7日后倒去細胞培養液，用4%多聚甲醛固定細胞，加入特異性的一抗和二抗，通過免疫熒光進行判斷，用Reed-Muench法計算病毒半數組織感染量（TCID₅₀）。

本發明構思將同一批桿狀病毒分別用常規的間接免疫熒光法和高效液相色譜法進行病毒的毒價測定，結果表明前者耗時8天完成了昆蟲桿狀病毒的毒價測定，而高效液相色譜法用4小時即可完成了桿狀病毒的毒價測定，且靈敏度高于前者，達到了設計要求。

發明內容

本發明的目的在于：提供的高效液相色譜儀進行昆蟲桿狀病毒定量的新方法，與間接免疫熒光法進行昆蟲桿狀病毒定量的常規方法比較，簡單、實用、快捷、靈敏。

本發明是這樣實現的：一種用高效液相色譜儀進行桿狀病毒定量的新方法，包括桿狀病毒的稀釋、桿狀病毒的固定、桿狀病毒的透化、桿狀病毒的染色、染色后的桿狀病毒在高效液相色譜儀上標準曲線的建立和待測樣本的定量；

溶液制備:

磷酸緩沖液（PBS）:稱取磷酸二氫鈉38.0g，磷酸氫二鈉5.04g，加超純水至1000ml，混勻。

5%的多聚甲醛固定液:稱取多聚甲醛5克，溶解于磷酸緩沖液（PBS）中，定容至100ml，即為5%的多聚甲醛固定液。

進樣緩沖液：稱取1.36克磷酸二氫鉀粉末，加超純水800ml，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液調整pH值至7.5，用超純水定容至1L。

其中1)桿狀病毒的稀釋：在凍存管中將已知和未知病毒毒價TCID₅₀(半數組織感染量)的桿狀病毒分別用磷酸緩沖液（PBS）進行10倍梯度稀釋（10^-1、10^-2…10^-7）；然后在凍存管中分別加入850μl的PBS和100μl梯度稀釋好的病毒備用；

其中2)桿狀病毒的固定：在上述1)凍存管內的桿狀病毒中加入20μl5%的多聚甲醛置于4℃，作用1h后，將其在液氮中放至10min后，置于37℃水浴中溶解，固定完畢備用；

其中3)桿狀病毒的透化：上述2)固定好的桿狀病毒中加入10μl10%的TritonX-100，室溫反應5min后，透化完畢備用；

其中桿狀病毒的染色：SYBR?Green?I染料進行200倍稀釋，在3)透化好的桿狀病毒中加入200μl稀釋好的染料，混勻后避光在80℃水浴作用10min，染色完畢備用；

用間接免疫熒光法測定的已知TCID₅₀的桿狀病毒作為標準品，按倍數方法稀釋成5份，準備制作標準曲線。

其中染色后的桿狀病毒在高效液相色譜儀上進行定量：

將上步的稀釋的樣品混合均勻，使用0.45μm的濾膜進行過濾，抽取200μl濾液加至液相色譜儀的進樣管中，使用BioSep?SEC-s2000色譜柱，進樣緩沖液為pH值7.5的0.1mol磷酸二氫鉀溶液，樣品溫度8℃，柱溫60℃，流速1ml/分鐘，進樣量為5μl，熒光檢測波長為概述：最大吸收波長約為497nm,發射波長最大約為520nm。

利用檢測的標準品制作標準曲線，標準曲線確立后，根據此標準曲線可以完成今后待測樣品的定量分析。

所述方法，使常規的桿狀病毒定量周期由8天縮短為4h，檢驗周期縮短了約48倍，提高了檢測的靈敏度。避免了人為判定造成毒價的誤差，同時節省了人力、物力，此法具穩定性和可重復性。