[發(fā)明專利]一種野生奧德蘑種類的鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310654406.7
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103667478A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李傳華;黃建春;譚琦;尚曉冬;張勁松;鮑大鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種野生奧德蘑鑒定方法，包括下列步驟：

（1）野外采集

先對從野外采集的野生奧德蘑子實體進行拍照，拍攝清楚菌蓋、菌柄、菌環(huán)和菌褶以及子實體周圍的生境；照片拍攝后采集奧德蘑野生子實體，測量并記錄其外部形態(tài)特征，并進行菌種分離；

（2）外部形態(tài)鑒定

將步驟（1）采集到的野生奧德蘑子實體的外部形態(tài)特征和現(xiàn)有的奧德蘑子實體的外部形態(tài)特征進行比對，找出相似種類；

（3）微觀結(jié)構(gòu)鑒定

將步驟（1）得到的奧德蘑野生子實體進行顯微結(jié)構(gòu)觀察，然后將野生奧德蘑與步驟（2）得到的相似種類的奧德蘑的顯微結(jié)構(gòu)進行比對，找到顯微結(jié)構(gòu)相似的種類；

（4）分子序列鑒定

1）DNA提取：提取總DNA，測定濃度后調(diào)節(jié)至100ng/μL備用；

2）PCR擴增：選用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增奧德蘑核糖體RNA部分18S、ITS1、5.8S、ITS2和部分28S的DNA片段；反應體系總量20μL，包含有Taq酶5U、Mg²⁺?1.5mmol/L、dNTP各200μmol/L、引物各1.0×10^-5μmol、模版DNA100ng；PCR反應程序94℃預變性5min，30個循環(huán)中94℃?50s、51℃?50s、72℃?1min，最后72℃延伸10min；

3）PCR測序：經(jīng)ITS擴增片段進行雙向測序，測序結(jié)果經(jīng)過比對拼接后確定最終序列；

4）ITS序列分析：將測序好的序列在Genebank中進行Blast比對；

（5）綜合鑒定：綜合外部形態(tài)特征、微觀結(jié)構(gòu)和分子序列比對的種類，綜合比較，準確確定野生奧德蘑的種類。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于：將步驟（1）中所采集到的奧德蘑野生子實體放入固定的器具中以免損壞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于：步驟（1）中所示的測量并記錄其外部形態(tài)特征包括：測量菌蓋直徑、菌柄長度和直徑，與比色卡進行比對并記錄菌蓋、菌柄、菌褶顏色及形狀，記錄其味道和氣味。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于：步驟（3）中所述的顯微結(jié)構(gòu)觀察的具體操作為：選取步驟（1）得到的奧德蘑野生子實體的菌褶少許，放入事先配置好的滴定有5%KOH溶液的載玻片上，待菌褶充分溶解還原后，蓋上蓋玻片，置于放大400倍的顯微鏡下觀察，觀察孢子、擔子、囊狀體、菌絲等顯微結(jié)構(gòu)的特征，并測量其大小，同時進行顯微照片拍攝。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于：步驟（4）中所述的提取總DNA的方法為采用改良的CTAB法提取總DNA，包括：

1）將-20℃冷凍干燥的野生奧德蘑子實體0.1g研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫45min以上，間或輕搖混勻；

2）12000rpm，4℃離心20min，取上清液；

3）加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中酚、氯仿和異戊醇的體積比為25：24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

4）加入等體積的氯仿、異戊醇混合液，其中的氯仿、異戊醇的體積比為24：1，輕輕混勻10min，12000rpm，4℃離心10min，取上清液移入新離心管中；

5）加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm，4℃離心10min，去上清；

6）將沉淀依次用體積百分數(shù)為75%的乙醇、10mmol/L醋酸鉀各洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；

7）加入預冷的體積百分數(shù)為95%的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；

8）加入100uL?10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；

9）加入1uL?10mg/mL?RNaseA?37℃水浴，1hr，去除RNA，即得DNA提取物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種野生奧德蘑鑒定方法，其特征在于：步驟（4）中所述的真菌通用引物ITS1為：5’-TCC?GTA?GGT?GAA?CCT?GCG?G-3’，ITS4為5’-TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC-3’。