[發(fā)明專利]利用半胱氨酸水解酶家族成員制備(-)γ內(nèi)酰胺的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310654389.7
• 申請日: 2013-12-09
• 公開（公告）號: CN103710324A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建軍;吳勝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P17/10
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及具有(+)γ內(nèi)酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶家族成員及其編碼基因，以及此類酶的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

目前，資源、能源和環(huán)境危機(jī)已經(jīng)威脅到人類的生存與發(fā)展。生物轉(zhuǎn)化是以微生物或酶作為催化劑，以可再生資源取代不可再生資源，大規(guī)模生產(chǎn)人類所需的化學(xué)品、醫(yī)藥、能源、材料等的有效手段。?

(-)γ內(nèi)酰胺是合成抗艾滋病藥物阿巴卡韋以及抗甲型流感及禽流感藥物帕拉米韋的重要的中間體。目前合成手性(-)γ內(nèi)酰胺的方法主要分為化學(xué)合成法，手性助劑共結(jié)晶法和生物酶促轉(zhuǎn)化法。化學(xué)法方法成本高、步驟煩瑣，而且催化過程中使用的重金屬催化劑嚴(yán)重污染環(huán)境。以手性助劑為拆分劑的方法收率較低，且終產(chǎn)物中有拆分劑殘留。生物酶法在合成手性(-)γ內(nèi)酰胺中，具有節(jié)約能源，效率高，對環(huán)境友好的特點(diǎn)。酶法拆分消旋體γ內(nèi)酰胺的反應(yīng)如下：?

能夠水解拆分消旋γ內(nèi)酰胺的酶被稱為γ內(nèi)酰胺酶。γ內(nèi)酰胺酶屬于酰胺酶的一種，γ內(nèi)酰胺酶主要應(yīng)用于(-)γ內(nèi)酰胺的手性合成中，(-)γ內(nèi)酰胺是制備阿巴卡韋及帕拉米韋的關(guān)鍵手性中間體。?

目前所報(bào)道的γ內(nèi)酰胺酶對消旋γ內(nèi)酰胺的拆分過程中存在的缺點(diǎn)主要是，γ內(nèi)酰胺酶對消旋γ內(nèi)酰胺酶底物的拆分不具有絕對選擇性，所以拆分效果依賴于拆分反應(yīng)的過度反應(yīng)，即需要超過50％的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。這種不具絕對選擇性的酶很容易造成產(chǎn)物光學(xué)活性降低或者目的光學(xué)產(chǎn)物的損失。此外，雖然來源于古細(xì)菌的γ內(nèi)酰胺酶具有絕對選擇性，但是其最適反應(yīng)溫度過高(80℃)，利用此酶進(jìn)行生產(chǎn)過程的能耗很大。?

本發(fā)明人之前曾從Microbacterium?hydrocarbonxydans(氧化烴微桿菌)中獲得了一個(gè)(+)γ內(nèi)酰胺酶基因，專利號201010210197.3，專利名稱：一種具有拆分消旋體γ-內(nèi)酰胺活性的(+)γ-內(nèi)酰胺酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明在此專利的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一類比氧化烴微桿菌(+)?γ內(nèi)酰胺酶活性更高，穩(wěn)定性更強(qiáng)的酶家族，即半胱氨酸水解酶家族。此家族成員在室溫(25℃)相比來源于氧化烴微桿菌的(+)γ-內(nèi)酰胺酶，具有更高的催化活性。半胱氨酸水解酶家族在拆分消旋體γ-內(nèi)酰胺的應(yīng)用方面沒有專利報(bào)告和文獻(xiàn)報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供十三種具有(+)γ內(nèi)酰胺拆分活性的半胱氨酸水解酶及其應(yīng)用。十三種酶分別來源于表1所示的微生物。?

表1本發(fā)明涉及的微生物及其半胱氨酸水解酶蛋白及編碼基因的序列編號?

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：?

本發(fā)明提供了十三種半胱氨酸水解酶家族成員，分別來自于表1中的細(xì)菌或真菌，其中。所述半胱氨酸水解酶家族成員分別是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：?

(a)由序列表中的SEQ?ID?No：1，SEQ?ID?No：2，SEQ?ID?No：3，SEQ?ID?No：4，SEQ?ID?No：5，?SEQ?ID?No：6，SEQ?ID?No：7，SEQ?ID?No：8，SEQ?ID?No：9，SEQ?ID?No：10，SEQ?ID?No：11，SEQ?ID?No：12或SEQ?ID?No：13的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；?

(b)將序列表中的SEQ?ID?No：1，SEQ?ID?No：2，SEQ?ID?No：3，SEQ?ID?No：4，SEQ?ID?No：5，SEQ?ID?No：6，SEQ?ID?No：7，SEQ?ID?No：8，SEQ?ID?No：9，SEQ?ID?No：10，SEQ?ID?No：11，SEQ?ID?No：12或SEQ?ID?No：13的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有(+)γ內(nèi)酰胺拆分活性的衍生的蛋白質(zhì)。?

其中，序列表中的SEQ?ID?No：1，SEQ?ID?No：2，SEQ?ID?No：3，SEQ?ID?No：4，SEQ?ID?No：5，SEQ?ID?No：6，SEQ?ID?No：7，SEQ?ID?No：8，SEQ?ID?No：9，SEQ?ID?No：10，SEQ?ID?No：11，SEQ?ID?No：12和SEQ?ID?No：13分另由205，173，231，178，220，197，269，222，186，200，216，206，和207個(gè)氨基酸殘基組成。?

上述半胱氨酸酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，下述核苷酸序列之一：?