[發明專利]用于制備去細胞肝臟支架的試劑盒及其使用方法有效

申請號：	201310654387.8	申請日：	2013-12-05
公開（公告）號：	CN103690997A	公開（公告）日：	2014-04-02
發明（設計）人：	程遠;潘明新;汪艷;李陽;高毅	申請（專利權）人：	南方醫科大學珠江醫院
主分類號：	A61L27/36	分類號：	A61L27/36
代理公司：	北京市立方律師事務所 11330	代理人：	劉延喜;王增鑫
地址：	510282 廣東***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	用于制備細胞肝臟支架試劑盒及其使用方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及肝臟組織工程領域，特別是涉及一種用于制備去細胞肝臟支架的試劑盒及其使用方法。

背景技術

在現有肝臟替代療法還存在不足的背景下，研制可供移植的組織工程肝臟十分必要。肝臟組織工程是構建可移植肝臟的一條創新型途徑，其核心內容是通過將肝臟種子細胞與生物支架材料相復合，構建出可移植的組織工程肝臟，用于對病損肝臟進行形態、結構及功能的永久性替代。目前，由于缺乏合適的支架材料，通常所構建的組織工程肝臟結構簡單，缺乏完善的血管網絡而不能達到肝臟替代的目的。

理想的肝臟支架材料的性能和結構要求包括：1、支架材料具有可生物降解性和生物相容性，降解產物不應有毒和引起炎癥；2、支架材料具有可加工性及孔隙大小、孔隙率的可調控性，為預血管化和血管生成創造條件；3、支架材料應有足夠的表面積用于細胞粘附，也應有足夠的空間使細胞集落、擴展及增殖。

目前常用支架材料主要包括兩類，一類是天然基質材料，如：膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質酸、海藻酸鈉和殼聚糖等，它們均有較好的生物相容性，可為細胞組織化生長提供微環境，但由于缺乏組織與器官構建中所需的血管床樣結構，且其形成的支架材料很難有較好的穩定性和機械性能，缺乏可加工性，導致天然基質材料在應用中存在一定的障礙。另一類是合成高分子聚合物，如：聚羥基乙酸（PGA）和聚乳酸（PLA）等，具有生物降解性好，力學性能良好，降解速度可控等優點，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。

目前肝臟組織工程中常用的支架材料是上述支架材料通過復合、修飾和改性等方法改造而來的材料，可為種植于其上的細胞提供更合適的環境因素，生長因子，及誘導新生血管形成的預血管化位點和多孔結構等。然而，由各種天然細胞外基質構成的復雜三維網狀支架，相對于肝細胞生長所需的復雜的肝臟結構來說，目前肝臟組織工程中常用的支架材料顯得過于簡單，不能很好地解決肝細胞生長所需要的營養輸送和廢物排出等問題。

去細胞支架材料作為一種天然的生物支架，相對于目前肝臟組織工程中常用的支架材料，不僅保留細胞粘附、增殖所依賴的細胞外基質成分，如：膠原蛋白及纖維粘連蛋白等，更重要的是保留細胞高密度生長所需要的管道結構，是最適合肝細胞生長的支架材料。但是，目前關于去細胞肝臟支架的制備方法還不完善，制備效果不夠理想。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種用于制備去細胞肝臟支架的試劑盒及其使用方法，去肝臟細胞效果穩定，能夠保留完整的細胞外基質結構及膠原蛋白和糖蛋白等成分。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種用于制備去細胞肝臟支架的試劑盒，試劑盒包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。

其中，溶栓液的各組分及濃度為：尿激酶100000IU/L、NaCL9g/L。

灌注液I的各組分及濃度為：EDTA?0.2g/L、NaCL?9g/L。

灌注液II的各組分及濃度為：十二烷基硫酸鈉5g/L、NaCL?9g/L。

灌注液III的組分及濃度為：DNase?I?0.01g/L。

灌注液IV的組分及體積濃度為：過氧乙酸0.01%。

其中，溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV的溶劑均為去離子水。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種用于制備去細胞肝臟支架的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

第一次灌注：通過經結扎肝動脈、膽管和去除膽囊處理的肝臟的門靜脈灌注500ml含100000IU/L尿激酶的生理鹽水溶液，灌注完成后，肝臟于-80℃存放48h以上。