[發(fā)明專利]氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)中氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310652661.8
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103675132A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳東
• 申請（專利權(quán)）人: 陳東
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 鄧曉安

1.一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，檢測方法步驟包括：

（1）取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液Ⅰ；

（2）細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品制備：取步驟1）得到的菌體，用生理鹽水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超聲破碎至細(xì)胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，離心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入內(nèi)標(biāo)物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ體積與內(nèi)標(biāo)物核糖醇重量比例為50~200ul:20μg，室溫真空烘干，得到細(xì)胞內(nèi)代謝物樣品Ⅰ；

（3）樣品衍生：在步驟2）得到的樣品Ⅰ中，分別加入50~150ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入50~150ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品Ⅰ，收集上清得到待測胞內(nèi)樣品Ⅰ；

（4）利用氣相色譜-質(zhì)譜對步驟3）得到的待測胞內(nèi)樣品Ⅰ，進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)采集。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達(dá)0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇為經(jīng)過冷浴槽預(yù)冷至-40℃；所述低溫萃取為-40℃至-50℃下萃取2~7h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為：氣相色譜：色譜柱為30?m×0.25?mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度300℃，檢測器溫度250℃，柱箱升溫程序平衡時(shí)間3?min→80℃維持1min?→2℃/min升溫至100℃→15℃/min升溫至220℃→30℃/min升溫至300℃→300℃維持3?min，進(jìn)樣體積1μL；質(zhì)譜：離子源EI，檢測器為四級桿，電離能70?eV，離子源表面溫度280℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，該方法應(yīng)用于檢測酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過程中的細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、糖、有機(jī)酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1~2或4~5任一項(xiàng)所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述糖為葡萄糖、果糖、木糖；所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸；所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測細(xì)胞內(nèi)氨基酸、糖、有機(jī)酸的方法，其特征在于，所述糖為葡萄糖、果糖、木糖；所述有機(jī)酸為琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸、富馬酸；所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。