[發明專利]微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標記方法

有效

• 申請號: 201310651906.5
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN103760355A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 李陽;張冠斌;蔣迪;項光新;邢婉麗;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物有限公司;清華大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標記方法。

背景技術

近幾年微陣列芯片技術的發展使得高通量地并行分析成千上萬的分子相互作用成為可能。DNA微陣列芯片方法已被廣泛使用，包括基因表達分析、突變分型、單核苷酸多態性（SNP）、短串聯重復序列（STR），對藥物開發、疾病診斷和司法鑒定起到重要作用。固定于微陣列芯片的特定核苷酸探針，充當解碼工具，通過空間上不同的位置把溶液中并行反應產生的多個靶標分子加以區別。這些探針甚至可以是通用探針，比如通用芯片上經過設計與人工合成的人造標簽（Tag）序列或者相互補的序列。微陣列芯片方法與多重PCR結合在一起，可用于檢測SNP與基因突變，包括堿基刪除、插入、以及長片段缺失，適用于常規的遺傳和診斷實驗室開展。

與此同時，蛋白芯片和化學芯片也已經發展成為蛋白質組學領域兩個重要的工具。結合多重PCR方法，特定的蛋白質、抗體、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固體表面形成微陣列芯片，類似于DNA微陣列芯片。這些分子的微陣列芯片可以用于分析單一的分子組成或者復雜的分子組成。

待檢樣本和固定在微陣列芯片表面的探針之間的相互作用可以通過多種方法加以檢測。通常情況下，微陣列芯片的檢測方法有基于熒光、化學發光或酶聯標記的光學檢測方法，基于酶標記、二茂鐵標記或其他電活性標記的電化學檢測方法，以及基于表面等離子共振技術或微天平分析技術的無標記的檢測方法。為了進一步簡化分析步驟和減少對儀器設備的依賴，磁珠標記方法也被采用，其結果可以用基于電荷耦合器件（CCD）的相機、攝像機或低倍顯微鏡進行成像分析，而且交叉反應和非特異性吸附能通過磁場或流體來快速地加以消除。用磁珠檢測微陣列雜交DNA開辟了一條新的途徑，在不需要對溶液中DNA的濃度進行精準的同時，實現常規的雜交試驗。

熒光分子的應用提高了靶標分子與微陣列芯片結合的檢測能力，當熒光分子同目標分子綁定后，顯示出了不同的信號強度和發射光譜。將熒光分子標記在特異擴增靶標片段的引物上，通過不對稱聚合酶鏈反應（PCR）富集靶標核酸片段，在各種SNP位點和基因突變的檢測方面已得到了廣泛的應用。但對于少量的臨床樣本，檢測精度極端重要，單步不對稱PCR由于其較低的靈敏度不能完成少量樣品的檢測。對于其他類型的檢測同樣也會因樣本量太少無法獲得足夠的熒光信號強度，從而導致無法得到相應的檢測結果。

以前的工作中提到的另一種方法是采用微球，優選順磁性微粒，由于其易于處理和良好的生物相容性，能夠使靈敏度進一步提高。通過對微球和標記了熒光的靶標分子進行修飾，便可以使熒光標記分子可以耦合到磁珠上，這樣每一個磁珠同時偶聯大量的熒光分子，從而獲得較高強度的發光能力的個體與微陣列芯片上面的探針進行雜交，從而獲得對靶標分子的檢測結果。目前這種方法主要應用于核酸分子檢測當中，采用聚合酶鏈反應（PCR）進行靶標分子的富集，在進行聚合酶鏈反應（PCR）過程中所添加到引物均進行了熒光分子和能與順磁性微粒相結合的化學修飾的雙標記，以達到獲得熒光信號的目的。

現有技術是將熒光分子標記在每一個靶標分子上，如：聚合酶鏈反應（PCR）過程中添加的引物均進行了熒光分子和能與順磁性微粒相結合的化學修飾的雙標記，這種標記方法，檢測成本過高，在富集靶標核酸分子方面也存在一定的抑制作用。理論上，靶標分子均需進行相應的化學修飾，以便能夠與順磁性微粒相偶聯，而在對靶標分子進行熒光標記可以采用不同方式來實現，并非是要全部并直接的將熒光分子標記到靶標分子上。

發明內容

本發明的目的是提供一種微陣列芯片檢測中核苷酸序列的顆粒標記方法。

本發明提供了一種在利用微陣列芯片檢測靶標分子的方法中對靶標分子進行標記的方法，該方法涉及到微陣列芯片和靶標分子；微陣列芯片上連接有若干種探針；靶標分子是若干種靶標分子的混合物，每種靶標分子中含有能與芯片上的某種探針結合的序列、還含有待測靶標位點的序列，一種靶標分子對應一種探針；

該方法包括如下步驟：顆粒表面包被上若干個功能基團，記作功能化顆粒；每種靶標分子都標記有修飾基團，記作修飾化靶標分子；所述功能基團與所述修飾基團能夠相互作用；利用功能化顆粒和發光基團使每種修飾化靶標分子都能發光，從而實現對靶標分子的標記。

上述方法中，所述利用功能化顆粒和發光基團使每種修飾化靶標分子都能發光的方法為如下（1）-（5）中任一所述的方法：