[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)Cry1Ab抗蟲(chóng)基因水稻品系mfb-MH3301的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310650382.8
• 申請(qǐng)日: 2013-12-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667476A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇軍;顏靜宛;王鋒;胡太蛟;陳在杰;林智敏;李剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及鑒定轉(zhuǎn)Cry1Ab抗蟲(chóng)基因水稻品系mfb-MH3301及其衍生品系的檢測(cè)方法及其所依賴的轉(zhuǎn)化體特異序列。

背景技術(shù)

水稻是我國(guó)乃至世界最主要的糧食作物之一。水稻也是蟲(chóng)害發(fā)生較為嚴(yán)重的作物之一。我國(guó)水稻田間害蟲(chóng)有600多種上，其中分布廣泛且為害較為嚴(yán)重的是二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲(chóng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)由蟲(chóng)害造成的損失占水稻總產(chǎn)量的5％以上，高達(dá)一千萬(wàn)噸，每年用于水稻害蟲(chóng)防治的費(fèi)用都在135億元人民幣以上。而在水稻品種及野生稻中沒(méi)有抗鱗翅目害蟲(chóng)的種質(zhì)資源可以利用。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的品種設(shè)計(jì)技術(shù)可以將遠(yuǎn)緣物種的抗性基因?qū)胨局校瑥亩宫F(xiàn)有品種獲得高抗蟲(chóng)特性。目前已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系獲準(zhǔn)進(jìn)入環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗(yàn)。對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的有效監(jiān)管是轉(zhuǎn)基因作物安全利用的前提和保障。轉(zhuǎn)基因作物外源序列插入片段旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系的最重要的分子身份證。因此，依據(jù)外源插入片段的旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)基因作物品系特異性檢測(cè)方法的重要技術(shù)資料。

mfb-MH3301是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所共同研發(fā)的抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟以及大螟的具有廣泛應(yīng)用前景的轉(zhuǎn)基因水稻品系。利用插入位點(diǎn)旁側(cè)序列特異性地鑒定轉(zhuǎn)基因品種（品系）是目前鑒定轉(zhuǎn)基因作物最可靠最特異的檢測(cè)方法，是準(zhǔn)確鑒別區(qū)分同一轉(zhuǎn)化體及其衍生品系的方法。

利用插入位點(diǎn)旁側(cè)序列鑒定轉(zhuǎn)基因品系，該方法已在鑒定克螟稻、Bt汕優(yōu)63、科豐6號(hào)和科豐8號(hào)品系中建立。mfb-MH3301是最新研發(fā)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻品系，尚無(wú)任何相關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301外源基因插入片段的旁側(cè)序列文章報(bào)道和專利。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)Cry1Ab抗蟲(chóng)基因水稻品系mfb-MH3301的檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，利用插入位點(diǎn)旁側(cè)序列特異性地鑒定轉(zhuǎn)基因品種（品系）是目前鑒定轉(zhuǎn)基因作物最可靠最特異的檢測(cè)方法，是準(zhǔn)確鑒別區(qū)分同一轉(zhuǎn)化體及其衍生品系的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

所述方法是轉(zhuǎn)化體mfb-MH3301中外源基因Cry1Ab及其表達(dá)框在水稻染色體上插入片段及其旁側(cè)特異序列SEQ?ID?NO:1及基于該序列建立的特異性PCR擴(kuò)增鑒定技術(shù)。

所述旁側(cè)序列為L(zhǎng)B端旁側(cè)序列，其LB端旁側(cè)序列如SEQ?ID?NO:1所示。

依據(jù)LB端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)的特異性引物為：

正向引物G92：5’-GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’；

反向引物Bb3301-L1：5’-CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’或?

Bb3301-L2：5’-CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’或

Bb3301-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。

所述特異性引物中一條引物為依據(jù)SEQ?ID?NO:1中1-500位序列設(shè)計(jì)的正向引物；另一條引物為依據(jù)SEQ?ID?NO:1中501-2000序列設(shè)計(jì)的三條反向引物中的任一條。

轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的外源插入片段的旁側(cè)序列的PCR檢測(cè)方法，所述PCR擴(kuò)增條帶中含有SEQ?ID?NO:1中的一段序列。

依賴于外源基因插入片段旁側(cè)序列的轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH3301的PCR檢測(cè)方法，可依據(jù)LB旁側(cè)序列檢測(cè)1個(gè)插入在水稻9號(hào)染色體上的位置。上述1對(duì)引物可用于轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的定性PCR檢測(cè)。

轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301所用載體見(jiàn)圖1，用于轉(zhuǎn)化目的基因Cry1Ab和選擇標(biāo)記基因hpt分別位于不同的二個(gè)獨(dú)立T-DNA區(qū)域，其中一個(gè)T-DNA區(qū)含有35S啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記基因hpt；另一個(gè)T-DNA區(qū)含有2條核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR系列、Ubi啟動(dòng)子和目的基因Cry1Ab。

本發(fā)明采用常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因水稻mfb-MH3301?DNA，利用Tail-PCR方法擴(kuò)增得到LB旁側(cè)序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，該序列包括水稻基因組序列，位于水稻第9號(hào)染色體（GeneBank?ID:?NC-008402.2?）的7709771-7710270位，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1中1-500位的核苷酸序列完全相同；該序列還包括了轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBb-Hyg的部分序列，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1中501-2000位的核苷酸序列完全相同。