[發明專利]一種轉Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301的檢測方法

有效

• 申請號: 201310650382.8
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103667476A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 蘇軍;顏靜宛;王鋒;胡太蛟;陳在杰;林智敏;李剛
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及鑒定轉Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301及其衍生品系的檢測方法及其所依賴的轉化體特異序列。

背景技術

水稻是我國乃至世界最主要的糧食作物之一。水稻也是蟲害發生較為嚴重的作物之一。我國水稻田間害蟲有600多種上，其中分布廣泛且為害較為嚴重的是二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲。據統計，每年我國由蟲害造成的損失占水稻總產量的5％以上，高達一千萬噸，每年用于水稻害蟲防治的費用都在135億元人民幣以上。而在水稻品種及野生稻中沒有抗鱗翅目害蟲的種質資源可以利用。以轉基因技術為核心的品種設計技術可以將遠緣物種的抗性基因導入水稻中，從而使現有品種獲得高抗蟲特性。目前已經有多個轉基因水稻品系獲準進入環境釋放和生產性試驗。對轉基因作物的有效監管是轉基因作物安全利用的前提和保障。轉基因作物外源序列插入片段旁側序列是轉基因植物品系的最重要的分子身份證。因此，依據外源插入片段的旁側序列是建立轉基因作物品系特異性檢測方法的重要技術資料。

mfb-MH3301是福建省農業科學院生物技術研究所和中國科學院遺傳與發育生物學研究所共同研發的抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟以及大螟的具有廣泛應用前景的轉基因水稻品系。利用插入位點旁側序列特異性地鑒定轉基因品種（品系）是目前鑒定轉基因作物最可靠最特異的檢測方法，是準確鑒別區分同一轉化體及其衍生品系的方法。

利用插入位點旁側序列鑒定轉基因品系，該方法已在鑒定克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號品系中建立。mfb-MH3301是最新研發的抗蟲轉基因水稻品系，尚無任何相關轉基因水稻mfb-MH3301外源基因插入片段的旁側序列文章報道和專利。

發明內容

本發明的目的在于提供一種轉Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH3301的檢測方法，屬于生物技術領域，利用插入位點旁側序列特異性地鑒定轉基因品種（品系）是目前鑒定轉基因作物最可靠最特異的檢測方法，是準確鑒別區分同一轉化體及其衍生品系的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

所述方法是轉化體mfb-MH3301中外源基因Cry1Ab及其表達框在水稻染色體上插入片段及其旁側特異序列SEQ?ID?NO:1及基于該序列建立的特異性PCR擴增鑒定技術。

所述旁側序列為LB端旁側序列，其LB端旁側序列如SEQ?ID?NO:1所示。

依據LB端旁側序列設計的特異性引物為：

正向引物G92：5’-GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’；

反向引物Bb3301-L1：5’-CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’或?

Bb3301-L2：5’-CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’或

Bb3301-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。

所述特異性引物中一條引物為依據SEQ?ID?NO:1中1-500位序列設計的正向引物；另一條引物為依據SEQ?ID?NO:1中501-2000序列設計的三條反向引物中的任一條。

轉基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的外源插入片段的旁側序列的PCR檢測方法，所述PCR擴增條帶中含有SEQ?ID?NO:1中的一段序列。

依賴于外源基因插入片段旁側序列的轉Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH3301的PCR檢測方法，可依據LB旁側序列檢測1個插入在水稻9號染色體上的位置。上述1對引物可用于轉基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的定性PCR檢測。

轉基因水稻mfb-MH3301所用載體見圖1，用于轉化目的基因Cry1Ab和選擇標記基因hpt分別位于不同的二個獨立T-DNA區域，其中一個T-DNA區含有35S啟動子和選擇標記基因hpt；另一個T-DNA區含有2條核基質結合區MAR系列、Ubi啟動子和目的基因Cry1Ab。

本發明采用常規方法提取轉基因水稻mfb-MH3301?DNA，利用Tail-PCR方法擴增得到LB旁側序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，該序列包括水稻基因組序列，位于水稻第9號染色體（GeneBank?ID:?NC-008402.2?）的7709771-7710270位，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1中1-500位的核苷酸序列完全相同；該序列還包括了轉化載體pCDMARUBb-Hyg的部分序列，其核苷酸序列與SEQ?ID?NO:1中501-2000位的核苷酸序列完全相同。